[发明专利]东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法

摘要

东北林蛙和卵油的分子鉴别方法，是为了解决对东北林蛙及其产品卵油的鉴定，目前仍主要依据性状特点、显微特征、理化性质等，这些依据由于缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，实践中对卵油的鉴定仍感到十分困难的技术问题而设计的。该鉴别方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，从而达到对东北林蛙和卵油的分子鉴别。具体实现步骤为：(1)基因组DNA提取；(2)基因组DNA检测与浓度测定；(3)PCR扩增；(4)PCR扩增产物鉴别。特点及有益效果：从分子生物学基本理论出发，应用现代分子标记技术对东北林蛙和卵油进行分子鉴别，具有理论基础科学可信，技术手段和实现步骤先进合理，及检测结果可靠等特点。以及所筛选引物特异性强，琼脂糖凝胶电泳特征谱带稳定性高，在实际应用中能够获得可靠而有益的效果。

主权项

1、东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于：该方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤为：(1)基因组DNA提取：①称取组织样品100～500mg，剪碎，放入灭菌的1.5ml的EP管中；②加入600μl 1×SET液、浓度为10mg/ml的蛋白酶K20μl、25μl SDS，温度在55℃的条件下，空气浴2小时；③加500μl Tris饱和酚和200μl TE上下颠倒10分钟；④以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑤加入等体积的酚:氯仿:异戊醇＝24:23:1，再补加200μl TE混合10分钟；⑥以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑦加入等体积的氯仿:异戊醇＝23:1，再补加200μl TE混合10分钟；⑧以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；⑨在-20℃温度下预冷，加入2倍体积的无水乙醇，水平摇动30次，用枪头挑出白色DNA沉淀；⑩加入700μl 70％的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；加入TE溶液50～100μl，置于55℃水浴3～4小时；在4℃下保存。(2)基因组DNA检测与浓度测定用紫外分光光度计测定DNA浓度：根据记录的OD260/280比值，估测DNA质量，OD260/280在1.6～1.8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以50ng/μl分装，作为工作液4℃保存使用。(3)PCR扩增采用特异引物(F：5′-GCC TTT CTA CCG CAA ATA-3′；R：5′-AGG TGCTTT TTT TCT GGG-3′)于PCR仪中进行扩增。(4)特异扩增产物鉴别扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，100V恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在1000bp处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卵油鉴别的特征谱带。