[发明专利]TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它：一，TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；二，门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A，三，Real-time PCR反应体系的建立；四，对粪便样品进行处理，五，对核酸进行；六，进行DNA灵敏性分析；七，特异性分析；八，多重Real-time PCR方法的建立；九，进行PCR结果判断；十，引物浓度选择：十一，特异性分析；十二，进行灵敏性分析；十三，进行多重荧光PCR。

主权项

一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它包括以下步骤：一、TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；首先选择实验菌种，菌株：沙门菌21株，副溶血性弧菌26株，大肠杆菌3株，李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，创伤弧菌、志贺氏菌、变形杆菌和假单胞菌各1株、溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌各1株，共58株标准菌株和参考菌株；二、门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A(invA)，根据Genbank公布的invA序列20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成，副溶血性弧菌荧光PCR的引物设计选取副溶血TLH(invA)；根据Genbank公布的TLH序列各个国家各个时期20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成；引物使用前12000rpm离心1分钟后，小心打开盖子，使用DEPC处理的蒸馏水进行稀释，稀释浓度为20Pmol毫升；稀释后涡旋1分钟，3000转离心30s后，-20℃储存备用，三、Real-time PCR反应体系的建立PCR反应体系采用大连宝生物公司的荧光PCR检测试剂盒，由于试剂盒中的MgCl2浓度和荧光信号检测温度都以做过优化，本研究将不做优化，引物浓度的优化采用矩阵法，引物体积优化范围在0.3-1.0μl，探针的优化范围也在0.3-1.0μl；体系将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可放入-20℃冰箱中保存，配制PCR反应液，PCR反应条件：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。四，对粪便样品进行处理，五，对核酸进行；六，进行DNA灵敏性分析，DNA灵敏度分析：按常规DNA提取方法提取模板DNA；用Bio-rad紫外可见光蛋白核酸分析仪测DNA的浓度。然后进行10倍稀释，每个稀释度取2ul用于实时PCR反应，根据检测的最低值检测出最低DNA浓度；七，特异性分析：将各种沙门氏菌属菌株和非沙门氏菌属菌株用TSB增菌液过夜增菌，取1mL增菌液提取DNA，取2μl作为模板，用建立的荧光PCR方法进行检测，以是否出现Ct值为判断阳性或阴性的标准；副溶血型弧菌特异性检测方法同沙门菌一致。PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)；八，多重Real-time PCR方法的建立：使用矩阵法优化得出最佳引物浓度进行双重荧光PCR方法的建立，将副溶血弧菌和沙门菌引物和探针放入一个管子中进行扩增，对反应结果反应体积为25μl，反应程序为：95℃3min变性后，以94℃15s、58℃45s进行45个循环。于58℃检测FAM、VIC通道的荧光信号；九，进行PCR结果判断：1，Ct≤37的样品，按照参比曲线计算浓度报告；2，37≤Ct＜40的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，故建议重复测定一次结果仍在此范围则定为阴性，反之按照参比曲线计算浓度报告；3，当Ct＝40或Ct＝0时，报告为阴性；十，引物浓度选择：对副溶血性弧菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是22.67，最高为24.65，相差1.92.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.4μl；对沙门菌的引物和探针进行矩阵分析，结果ct值最低是17.26，最高为18.34，相差1.08.选取ct值较低，信号线较高，同时引物和探针偏低的矩阵组合作为最佳引物组合，浓度为：上游引物、下游引物0.3μl，探针0.5μl；十一，特异性分析对所有的沙门菌和副溶血性弧菌都分别用优化后的反应条件对本实验室保存的21株沙门菌、1株枸缘酸杆菌、2株产LT和ST的ETEC、2株产LT的ETEC、4株不产毒ETEC、3株EIEC、2株EIEC血清型大肠埃希菌、3株福氏2a志贺菌、11株福氏4a志贺菌、1株福氏1b志贺菌、7株福氏2b志贺菌、12株福氏4c志贺菌、6株宋内氏志贺菌，进行了Real-time PCR检测，阳性和阴性符合率为100％；十二，进行灵敏性分析；十三，进行多重荧光PCR；