[发明专利]一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法

摘要

一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法，属于发酵工程领域。本发明提供了一种通过芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌突变菌株为宿主细胞，高效分泌表达具有α-淀粉酶活性的高温α-淀粉酶及其突变体的方法。本发明的重组菌，在分批流加发酵时合成与分泌高温α-淀粉酶或其突变体的水平达到18～25mg/mL，是原始菌株高温α-淀粉酶合成水平的3～4.5倍。本发明有助于降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。

主权项

1、一种高温α-淀粉酶BLA及其突变体的高效制备方法，其特征是：(1)重组表达质粒pHY-amyL或pBL-amyL、pHY-amyLc或pBL-amyLc、pHY-amyL1、pHY-amyL2、pHY-amyL4、pHY-amyL8、pHY-amyLL的获得：将amyL基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载体pHY-WZX或pBL-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的BLA表达质粒pHY-amyL或pBL-amyL；以pBL-amyL为基础，通过网站http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/进行密码子优化及基因全合成，获得密码子优化的BLA编码新基因amyLc，如序列SEQID NO：3；基因的编码产物命名为BLA-Lc。将amyLc基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，分别克隆入表达载体pHY-WZX或pBL-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒pHY-amyLc或pBL-amyLc；以pBL-amyLc为基础，通过多点突变及人工基因全合成技术，获得BLA突变体编码基因amyL1如SEQ ID NO：4、amyL2如SEQ ID NO：5、amyL4如SEQID NO：6、amyL8如SEQ ID NO：7、amyLL如SEQ ID NO：8；相应基因的编码产物命名为BLA-L1、BLA-L2、BLA-L4、BLA-L8、BLA-LL，BLA突变体编码基因分别经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，分别克隆入pHY-WZX表达载体的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒pHY-amyL1、pHY-amyL2、pHY-amyL4、pHY-amyL8、pHY-amyLL；(2)宿主细胞B0204(ΔamyL)的获得用于BLA及其突变体高效表达的宿主细胞，选择使用地衣芽孢杆菌工业菌株CICIM B0204，对其基因组中的BLA编码基因amyL及其上下游序列先进行删除；以寡核苷酸序列SEQ ID NO：9和序列SEQ ID NO：10为引物，用PCR技术从B0204基因组中扩增出上游序列Up；以寡核苷酸序列SEQ ID NO：11和序列SEQ ID NO：12为引物，用PCR技术从B0204基因组中扩增出距amyL下游3kb的PCR产物Dn，将Dn片段用SalI、XhoI双酶切后，克隆入pBlueScriptSK(-)的SalI位点，获得质粒pSK-Dn；将Up序列用PstI酶切后，克隆入质粒pSK-Dn的SmaI和PstI位点之间，获得重组质粒pSK-Up-Dn；将来源于pSKsym-Gm的GmR片段克隆入pSK-Up-Dn的EcoRI位点，获得用于BLA编码基因及其上下游序列突变的重组质粒pSK-Up-GmR-Dn；将重组质粒pSK-Up-GmR-Dn用电穿孔法转化入地衣芽孢杆菌B0204菌株，在LB培养基中补加终浓度2μg/mL庆大霉素和1％淀粉的选择性培养基上筛选突变株，以在选择性培养基上生长并且淀粉水解透明圈消失作为突变株的筛选指标，筛选得到缺失amyL的突变株B0204(ΔamyL)；(3)BLA及其突变体的分泌表达将上述获得的重组表达质粒pHY-amyL、pHY-amyLc，pHY-amyL1、pHY-amyL2、pHY-amyL4、pHY-amyL8、pHY-amyLL用电穿孔法分别转化入地衣芽孢杆菌突变株B0204(ΔamyL)，用含卡那霉素10μg/mL和四环素50μg/mL的LB平板，于37℃培养2～3天，筛选获得相应重组菌B0204Δ-L、B0204Δ-Lc、B0204Δ-L1、B0204Δ-L2、B0204Δ-L4、B0204Δ-L8、B0204Δ-LL。