[发明专利]一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法及应用。首先选取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠，并对SCID小鼠用放射线进行全身照射；其次是取人胚胎胸腺细胞。细胞来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者胚胎的胸腺，细胞数量为1×10⁷个，其中胸腺细胞与胸腺上皮细胞及其它基质细胞的数量比例为1∶1，并用α-GalCer-CD1d四聚体特异性清除幼稚与成熟NKT细胞；第三是将得到的胚胎胸腺细胞皮下注射至SCID小鼠胸腺中，进行皮肤移植，得到一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型。通过将人胚胎胸腺细胞植入重度联合免疫缺陷小鼠的胸腺中，将人胚躯干部全层皮肤移植至SCID小鼠胸腔上，再现了人体内皮肤移植反应的免疫耐受和排斥反应。本发明重复性好，效果显著，方法简单，具有良好的应用前景。

主权项

1、一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法，步骤如下：A、选取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠，在细胞移植前4个小时，对每只SCID小鼠进行放射线全身照射，照射剂量为200-350cGy；B、制备人胚胎胸腺细胞：人胚胎来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，细胞HLA分型为HLA-B8+/HLA-DQ5+，自胚胎中剥离胸腺组织，去除被膜，生理盐水洗涤，将组织剪成碎块，用RPMI-1640培养液洗涤，往胸腺碎块中加入RPMI-1640培养液，搅拌20min，研磨分散细胞，在研磨过程中用RPMI-1640培养基冲洗，过200目筛网，收集筛下滤过物，再将滤过物用RPMI-1640培养基洗涤，离心，收集此细胞为胸腺细胞，收集筛网上残余的胸腺组织碎片，加入胶原酶-中性蛋白酶溶液在37℃温箱中消化三遍，每遍20min，再加入EDTA-胰酶在37℃温箱中继续消化三遍，每遍15min，最后加入RPMI-1640培养基重悬细胞，过200目筛网，收集筛下滤过物，为胸腺上皮细胞及其它基质细胞，洗涤，离心，收集细胞，按数量比例为1：1混合胸腺细胞和胸腺上皮细胞并收集，最后用α-GalCer-CD1d四聚体通过流式细胞仪将成熟与未成熟NKT细胞特异性清除；C、将步骤B中得到的人胚胎胸腺细胞用1×PBS缓冲液制成单细胞悬液直接皮下注射至SCID小鼠的胸腺内，SCID小鼠取仰卧体位，在皮肤上作一个4-5mm的横切口，切口位于第二肋间隙处，垂直于胸骨，位于SCID小鼠两前臂连接的遐想线上，注射针经胸骨一旁的肋间隙进入到胸腺叶，进针角度为注射针针头与胸骨成30°-40°，缝合，关闭创口；D、制备人胚胎躯干部全厚层皮肤：皮肤来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，HLA分型为HLA-A2+/HLA-DRB1+，自妊娠者取出人胚，消毒，铺单，剪下人胚胎躯干部全厚层皮肤置于含1×PBS缓冲液的培养皿中，并用镊子剥去皮肤上的脂肪组织，此步骤至少重复2-5次，直到脂肪组织完全被剔除，最后将剪下的躯干部全层皮肤切成统一大小的移植片，置于4℃预冷的生理盐水中待移植；E、将步骤D中制备好的人胚躯干部全厚层皮肤移植至步骤C中己注射了人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠中，得到人鼠嵌合模型humanizedskin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera。