[发明专利]一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法

摘要

本发明属于植物病害分子检测领域，涉及油菜菌核病早期快速分子检测方法。特征包括：采集凋谢的油菜花瓣，提取油菜花瓣总DNA，巢式PCR，PCR扩增产物分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。如样本中存在核盘菌，在紫外光下琼脂糖凝胶中就会出现一条292bp的目的条带；不是则否。本发明的引物不仅可区分亲缘关系较远的不同属的常见植物叶部病原真菌，如交链孢属的链格孢霉、镰孢属的禾谷镰孢菌和盾壳霉属的核盘菌菌核寄生真菌盾壳霉，且可区分与核盘菌同属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目的常见重要植物叶部病原真菌葡萄孢属的多个种的真菌；其灵敏度高，可检测下限至1fg/μl的核盘菌DNA；本发明快速，7小时内即可得到准确的检测结果，传统微生物学方法至少需2天或1周以上。

主权项

1、一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法，其特征在于下列步骤：(1)采集油菜花瓣：先将1.5ml Eppendorf管灭菌，将待测的随机取样于田间凋谢的油菜花瓣，按一片花瓣装入一个Eppendorf管，将采集的花瓣样本置于-80℃冰箱中冷冻；(2)提取油菜花瓣总DNA：将装有油菜花瓣的Eppendorf管从-80℃冰箱中取出，迅速加入200μl抽提缓冲液，使之浸没过花瓣；用家用微波炉的低火档加热所述的样本，处理时间和顺序依次为20s，20s，15s，以样本不沸腾为宜；从所述微波炉中取出样本后立即再加入200μl抽提缓冲液；80℃水浴5min，中间轻轻摇晃一次；分别加入200μl苯酚和200μ1氯仿，轻轻混匀；于12,000rpm离心10min，取上清液，加入800μl-20℃预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置沉淀20min；于12,000rpm离心10min，弃上清，取沉淀置于37℃下干燥约10min；加入15μl ddH2O，37℃下静置约5min，沉淀溶解，得到油菜花瓣总DNA；(3)巢式PCR反应：第一次PCR：以ITS4/ITS5为引物进行第一次PCR，扩增反应体系为：PCR buffer，10pmol引物ITS4，10pmol引物TTS5，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，10μl步骤(2)制备的油菜花瓣总DNA，以ddH2O补足25μl，将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增；PCR反应参数为：95℃4min；94℃30s，50℃45s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。第二次PCR：以XJJ21/XJJ222为引物的第二次PCR，扩增反应体系为：PCR buffer，10pmol引物XJJ21，10pmol引物XJJ222，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，1μl第一次PCR产物，以ddH20补足25μl；将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增，PCR反应参数为：95℃4min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；(4)PCR扩增产物分析取4μl第二次PCR扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；(5)结果判定：将琼脂糖凝胶置于紫外光下，判定是否存在一条大小为292bp的目的条带；其中：步骤(2)所述的抽提缓冲液配方为：2％十六烷基三乙基溴化铵(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化钠，0.1M三羟甲基氨甲烷-盐酸(pH8.0)，0.02M乙二胺四乙酸；步骤(3)所述的本发明设计的特异引物序列如下：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’；TTS5. 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’；XJJ21：5’-GTT GCT TTG GCG TGC TGC TC-3’；XJJ222：5’-CTG ACA TGG ACT CAA TAC CAA TCT G-3’；步骤(4)所述的电泳缓冲液(5×TBE)配方为：Tris54g，硼酸27.5g，加入0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml；工作浓度为0.5×TBE。