[发明专利]一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法

摘要

本发明涉及一种有效降低曼地亚红豆杉(Taxus x media)细胞合成C-14位氧化紫杉烷(C-14 oxygenated taxoids)的方法，属于基因工程的技术领域，是通过根癌农杆菌介导的双元载体转化系统将针对红豆杉紫杉烷14β羟基化酶基因(简称14OH)片段构建的RNA干涉载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)培养细胞中。利用优化的转化方法成功地获得了转基因细胞。PCR-Southern杂交、RT-PCR基因表达分析和化学成分检测结果显示：曼地亚红豆杉细胞转基因试验取得成功，转基因细胞系中14OH基因mRNA表达水平发生显著地下降。本发明显著抑制了曼地亚红豆杉细胞向C-14位氧化紫杉烷的流向，有望使代谢流向包括抗癌药物紫杉醇(taxol)和及其前体巴可亭III(baccatin III)在内的C-13位氧化紫杉烷(C-13oxygenated taxoids)，从而为提高紫杉醇的生物合成产量提供一条新方法。

主权项

一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于，它包括以下步骤：a)从红豆杉中克隆得到14β羟基化酶基因(简称14OH)片段；b)构建RNA干涉载体，载体宿主菌为根癌农杆菌；c)转化红豆杉愈伤组织，转化条件为将含有目的RNA干涉载体的根癌农杆菌活化稀释，转化对数生长期悬浮培养一天后的红豆杉愈伤组织，共培养2-3天后，清洗，转入含有抗生素的培养基中培养；d)PCR和southern检测转基因细胞；e)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。