[发明专利]一种海洋溢油生物毒性快速检测方法

摘要

本发明涉及一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，该方法通过发光细菌作为检验海洋溢油生物毒性的受试生物，同时利用人工海水配制水融合组分(WAF，water accommodation friction)，解决了以往发光细菌实验中由于应用纯水作为配制水融合组分的溶剂，从而降低了海洋发光细菌的盐度，改变了发光细菌的生活条件而给实验带来的误差。

主权项

1、一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，其特征在于，该方法步骤如下：一、发光细菌的培养：菌种采用明亮发光杆菌T3变种(Photobacterium phosphoreum)，制备发光菌新鲜菌悬液：(1)斜面菌种培养：在新鲜斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，25℃±0.5℃培养24h后再转接第三代斜面，25℃±0.5℃培养24h后备用；(2)摇瓶菌液培养：取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培养24h备用；(3)将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升10⁸个～10⁹个细胞，初始发光度不低于800mV，备用；斜面和菌液的营养基为：胰蛋白胨  0.5g  NaCl  3g    Na₂HPO4  0.5g   KH₂PO4  0.5g酵母   0.5g     甘油  0.3g  蒸馏水   100ml  固体培养基加琼脂  1.69g二、水融合组分的制备：配置人工海水作为WAF中的水溶液和稀释水溶液，人工海水的配方为：NaCl         20gMgSO₄        3.6gMgCl         7.2g无水CaCl₂    0.7g蒸馏水       1000ml将润滑油设置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L 7个载荷率梯度；制备WAF溶液，如果试验材料比水密度小，应采用从容器底部搅拌试验材料的搅拌器，而对于那些密度比水大的试验材料，则应采用从容器顶部搅拌试验溶液的搅拌器，搅拌器的搅拌速度应该适当、匀速，为1200-1500rpm/min，一般液面漩涡的深度为WAF溶液制备容器中试验液高度的10％-35％，搅拌时间为24h，搅拌后，静置4h；三、发光细菌相对发光度的测定测定时的室温要控制在20～25℃，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃。取若干试管，给每支作为对照管的试管加1.98ml的人工海水，给每支作为样品管的试管加1.98ml的WAF溶液。向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测；四、半数效应载荷率EL₅₀的确定：(1)绘制试验材料载荷率(mg/L)与其相对发光度(％)的相关曲线或相关方程；(2)在相关曲线坐标图上，相对发光度50％处画一水平线，与相关曲线有一交点，该点的载荷率即是半数效果载荷EL₅₀值，如建立了相关方程，也可代入该方程求出样品的FL₅₀值；(3)根据的EL₅₀值鉴别不同油品的生物毒性。