[发明专利]重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用

摘要

本发明公开一种使用巴斯德毕赤酵母进行表达的重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用。包括下述步骤：(1)编码FIP-fve基因的克隆；(2)重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建；(3)重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得；(4)重组FIP-fve的诱导表达和纯化。本发明通过克隆编码金针菇免疫调节蛋白，构建巴斯德毕赤酵母表达载体，获得大量高产率和高纯度的重组金针菇免疫调节蛋白，5升发酵工艺获得的重组蛋白产量达300mg/L～350mg/L，纯度达90％以上，经纯化后检测其生物学特点和免疫生理活性与天然金针菇免疫调节蛋白相同，具有凝血活性，促进小鼠淋巴细胞增殖及分泌白介素和干扰素的功能，并能诱导肿瘤细胞凋亡。

主权项

1、重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法，其特征在于包括下述步骤：(1)、编码FIP-fve基因的克隆：取干燥金针菇菌丝体在液氮研磨后，加入DNA提取液，获得基因组DNA，根据GenBank中已登录FIP-fve蛋白质序列(Accession P80412)设计PCR引物，在引物上游加入ATG以便增强重组免疫蛋白的表达效率和准确性；(2)、重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建：将克隆的目的基因与载体pPIC9一起经过酶切，回收和连接，然后转化至大肠杆菌中，提取质粒pPIC9-FIP-fve；(3)、重组巴斯德毕赤酵母转化子的获得：将上述构建好的重组酵母表达载体pPIC9-FIP-fve用BglII酶切线性化，采用电转法将目的基因转入酵母GS115中表达，经转化后的酵母菌液涂布于HIS缺失的选择培养基MD上，28℃至少培养3天分别挑至MM和MD培养基对比，提取转化子酵母的总DNA；(4)、重组FIP-fve的诱导表达和纯化：选取正确的酵母转化子，首先用摇瓶500-1000ml振摇培养诱导重组蛋白表达，确定其有表达后，挑选其中表达量高的酵母菌进行5L发酵罐大量培养，发酵上清经透析后SDS-PAGE检测，并用君意凝胶分析系统测定目的蛋白产量，摇瓶发酵的产量至少为158.2mg/L，5L发酵罐的产量至少为300mg/L～350mg/L，样品进一步通过超滤系统超滤浓缩，4℃的低温透析后用血细胞凝集实验确定其活性，并进行DEAE-A25离子柱层析纯化，再进一步用高效液相色谱进行纯化，收集具有生理学活性的目的蛋白，最后检测重组FIP-fve的纯度。