[发明专利]一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法

摘要

本发明涉及一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法，其以海洋样品为分离源，通过卤代酸单一碳源液体培养基富集培养，卤代酸单一碳源显色平板筛选，菌株的分离纯化，菌体在卤代酸液体培养条件下催化脱卤情况检测四个步骤可以最终得到海洋卤代酸脱卤微生物。本发明适用于环境保护、污水处理、医药中间体、含氯农药等工业领域和实验研究领域。

主权项

一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法，其特征在于：以海洋样品为菌株分离源，以卤代酸为单一碳源进行富集培养，经过显色平板和液体培养筛选得到具有卤代酸脱卤能力的菌株，具体工艺步骤如下：1)取海洋样品，称重，样品于装有无菌海水的烧杯中洗涤3～5次，洗去样品表面附着的微生物和其它杂质；2)将样品放入灭菌后的研钵中，加入无菌海水，无菌海水的加入量为5-10mL无菌海水/g样品，研磨至均匀的浆液；取浆液1-10mL加入100mL卤代酸液体培养基中，在三角烧瓶中20～40℃，150～250转/分摇瓶培养；观察培养液颜色变化由蓝色变为橙红色时，取1-10mL摇瓶中的培养液加入至100mL新的卤代酸液体培养基中，继续摇瓶培养；3)观察菌液再次变为橙红色时取培养液0.5mL，加入装有4.5mL无菌海水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；再取上述混匀后的菌液0.5mL，加入装有4.5mL无菌海水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；重复上述操作过程6-9次，使最终菌液的浓度稀释到原培养后浓度的10-6-10-9；4)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液50-200ul涂卤代酸显色培养基平板，每个备用菌液涂5～10个平板；25～35℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长与情况，当平板上出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在卤代酸显色平板上划线；划线后的平板再于25～35℃培养箱中倒置培养3～5天，挑取深红色的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这一过程3～5次；5)挑选深红色的菌落接种2216E平板，培养2～3天后挑取单菌落接种2216E液体培养基在试管中25～35℃，150～250转/分培养24～48小时，观察培养液出现明显浑浊后取菌液加入装有体积浓度15-20％甘油水溶液的冻存管中颠倒混匀后-70℃放置保存备用；6)在菌株生长的2216E平板上，取1环菌体接种到装有100～200mL卤代酸液体培养基的三角烧瓶中，培养基中卤代酸浓度10～30mM，25～35℃，150～250转/分摇瓶培养；3天后分光光度计检测菌液在600nM波长检测光下吸光值，HPLC检测菌液中残留卤代酸量，OD600值≥1，卤代酸降解率≥50％的菌株即为高活力卤代酸脱卤菌株。