[发明专利]小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法

摘要

本发明涉及一套小轴海绵(Anixella sp.)不同类型细胞和细胞团的分离制备方法，通过特异性聚集和各种离心技术相结合，富集得到了四种不同类型的细胞，其中包括富含活性化合物Debromohymenialdisine和Hymenialdisine的小球细胞，并制备了三种不同类型的细胞团。本发明为海绵细胞鉴定及代谢产物的定位研究提供了一套完整的细胞分离方法，为活性产物的提纯提供了优化的提取材料，为细胞团体外培养研究和活性产物代谢提供了新颖而全面的对象体系。

主权项

小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，(1)小球细胞特异聚集：取健康洁净的小轴海绵组织，切成约0.5 2mm厚的片状，在含高浓度的乙二胺四乙酸二钠EDTA的无钙镁海水CMFSW中用镊子轻轻挤压，得到的混合细胞液经300 350目筛绢过滤后于平皿中静置，待小球细胞特异聚集成团块后，水平振荡平皿使聚集体重悬，待其自然沉降后吸取上清细胞悬液，为细胞悬液A；并添加含EDTA的CMFSW，反复进行水平振荡平皿、吸取上清细胞悬液和添加含EDTA的CMFSW的操作，平皿中剩余的细胞聚集体即为小球细胞富集体，对该聚集体用无菌天然海水进行培养，得到I型细胞团；(2)低速离心：将细胞悬液A离心，离心力30 40g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到细胞悬液，为细胞悬液B，接种至无菌天然海水中培养得到II型细胞团；(3)速率沉降：将细胞悬液B，经蔗糖或泛影葡胺介质速率沉降后收集中间细胞条带，离心后重悬得到细胞悬液，为细胞悬液C；(4)高速离心：将细胞悬液A经30 40g离心后的上清细胞悬液再次离心，离心力90 110g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到的细胞悬液，为细胞悬液D)接种至无菌天然海水中培养，得到III型细胞团；(5)密度梯度离心：细胞悬液C，经密度梯度离心可分别得到灰细胞和原细胞的富集体，细胞悬液D经密度梯度离心，得到领细胞的富集体。