[发明专利]半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法

摘要

一种半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法，包括抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收、cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析；建立了分离和克隆半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的技术，获得了抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段。本发明系首次分离到半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段。本发明的特点是可快捷的获得半滑舌鳎抗鳗弧菌特异片段，方法简便；所得结果可应用于半滑舌鳎抗病基因的定位克隆。

主权项

1. 一种半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析，其特征在它的技术内容包括如下三个方面：1)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收；2)特异cDNA-AFLP片段的克隆；3)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析：1)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收选取能扩增出496bp抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有496bp抗鳗弧菌特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用；2)、特异cDNA-AFLP片段的克隆将回收的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，采用标准的方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆；3)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析选取阳性克隆，测序后进行序列分析；将来自6个阳性克隆的抗鳗弧菌特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAstar进行多序列比对，其同源性为99.21％，表明各个个体得到的条带是同一个序列；半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列为：tgtgggagccctgggtggcctcacaggtcacagtggtcaccttcatccactggtcagcagggagcctcagcgtgctgctccagctgtagtggccgtccttctccatcagcccacggctcctgctctcctcccagctgctgctgctgatgataccgcccaccttccaggacagagtccagtctgaggggaagcccttgttggccagacacgtgagcgtggccttaccctgctgcagctcctggctggagggaggcagcactgtcagggtggggggggcaaaaactccaacatcgagtctggttcctccaccaaaagtgtacagttcccatttgctagcatcaaattcacccagacagtagtaaactgcagcatcttcagcctggactccactgatggtcagagaaaagtcagagtttgatccactgcctgtaaaacgatctggaattcctgattctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcg