[发明专利]一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法。该方法包括以下步骤：(1)无菌苗的获得及培养，(2)甘薯茎段的预培养，(3)菌株的活化剂菌液的制备，(4)农杆菌侵染和共培养，(5)农杆菌脱菌及不定芽再生，(6)甘薯小芽的分割及生根，(7)转基因植株的筛选，(8)检测及移栽。本发明提出了一个甘薯遗传转化的新方法，以甘薯茎段为外植体，通过对其侵染及诱导不定芽获得转基因植株，适用于多种基因型，且再生速度快，是一个能够用于甘薯转基因育种的可靠体系。

主权项

1、一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，步骤包括无菌苗快繁，以甘薯茎段为受体的遗传转化，不定芽再生及小苗生根，抗生素筛选和小苗移栽，其特征在于：所述以甘薯茎段为受体的遗传转化方法是：将培养20-30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2个节，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽；再将经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3天；然后将上述暗培养的甘薯茎段在OD600为0.6-1.0的农杆菌悬液中侵染10-15分钟，而后用无菌滤纸吸去菌液，切面朝下置于继代培养基上，23℃-25℃下暗培养5天；所述不定芽再生及小苗生根的方法是：将上述暗培养5天的甘薯茎段用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽；当甘薯茎段上的不定芽长至1厘米时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，培养14±1天，进行生根；所述抗生素筛选的方法是：将已生出1-2cm根的甘薯小苗不伤及根部取出，转接到含相应抗生素的筛选培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，培养14±1天；其中所述筛选培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，并添加200mg/L头孢噻肟钠和25mg/L卡那霉素，pH5.8。