[发明专利]一种组织工程人角膜内皮的重建方法

摘要

本发明涉及一种组织工程人角膜内皮的重建方法，是利用20％小牛血清-DMEM/F12培养液将角膜内皮细胞体外培养至对数生长期，采用胰蛋白酶消化获得完全脱上皮层的羊膜载体支架，平铺在培养板孔中牢固干贴后，将悬浮于含有IV型胶原蛋白和20％小牛血清的DMEM/F12培养液的对数生长期人角膜内皮细胞，接种至在平铺有羊膜载体支架的培养板孔中启动体外培养，进行组织工程人角膜内皮的体外重建。本发明工艺科学合理，所重建的组织工程人角膜内皮可用于批量生产，满足角膜内皮盲临床角膜移植治疗对组织工程人角膜内皮的大量需求，且组织工程人角膜内皮体外重建和临床治疗的成本低。

主权项

1、一种组织工程人角膜内皮的重建方法，首先利用含20％小牛血清的DMEM/F12培养液对人角膜内皮细胞进行扩增培养，经0.25％胰蛋白酶溶液消化和1000～1500转/分离心10～15分钟获得人角膜内皮细胞沉淀，用DMEM/F12培养液、20％小牛血清和0.05％～0.1％IV型胶原蛋白组成的组织工程人角膜内皮重建专用培养液将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液；然后，利用0.25％胰蛋白酶对冻干羊膜的上皮面进行倒置消化以制备完全脱去上皮层的羊膜，并用打孔器将该脱上皮层羊膜打成与培养板孔直径相同的羊膜圆片；最后，按上皮面朝上将脱上皮层羊膜圆片平铺于48孔培养板孔的底部，放在37℃培养箱中干贴牢固后制成羊膜载体支架，将上述人角膜内皮细胞悬液0.1～0.2毫升接种在平铺有上述羊膜载体支架的培养板中，待人角膜内皮细胞全部贴附在上述羊膜载体支架上后，再补加上述专用培养液并使液面达到培养孔高度的3/4，待人角膜内皮细胞在羊膜载体支架上长成单层即为重建的组织工程人角膜内皮。