[发明专利]一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法

摘要

一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，属于固定化果糖基转移酶的技术领域。本发明包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分，本发明筛选出了大孔阴离子树脂D380、D296R、或D301-III为载体，以戊二醛为交联剂，采用先吸附后交联的方法进行固定化；本发明操作简单，成本低，酶活回收率已达到较高水平，制备的固定化酶可回收重复使用，可降低生产成本。载体材料价格低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，树脂吸附酶间接起到提取作用，因此对于粗酶液的纯度没有过高的要求，有利于工业化生产，所得固定化酶酶活回收率可达81.2％以上，可循环使用10次。

主权项

1、一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，其特征在于包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分，工艺步骤如下：(1)游离果糖基转移酶的制备：将产酶黑曲霉经发酵培养，离心收集菌体，加菌体质量5-10倍量的缓冲液破壁提取其胞内酶，冷冻离心，超滤浓缩得粗酶液，冰箱保藏备用；浓缩粗酶液用柠檬酸-磷酸缓冲液稀释至一定浓度并调节pH 3-7.6，游离果糖基转移酶稀释酶液的酶活90-120U/mL；(2)果糖基转移酶的固定化：树脂的预处理：以大孔阴离子树脂D380、D296R、或D301-III为固定化载体，大孔阴离子树脂先用蒸馏水浸泡胀润，除杂，然后用质量浓度4％的NaOH溶液浸泡4h，再用4％的HCl溶液浸泡4h，然后用去离子水冲洗至中性，最后用树脂2倍体积以上去离子水浸泡，湿树脂于4℃冰箱中保存备用；酶的固定化：称取0.5g所得湿树脂于三角瓶中，加入10mL的游离果糖基转移酶稀释酶液，在pH 6.0～7.0、20-30℃下，以100-200rpm的转速振荡吸附2-8小时后取出；加入稀释酶液总体积0.01％-0.05％的质量浓度为25％的戊二醛溶液，于4-10℃、60-80rpm缓慢振荡下交联4-8小时后，过滤，用缓冲溶液洗涤，冲洗戊二醛残留及未固定上的游离酶，直至洗出液中无酶活力，即得固定化果糖基转移酶，用缓冲液浸泡待用。