[发明专利]一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法

摘要

一种基于体内同源重组构建酵母整合型基因突变文库的方法，属于蛋白质工程，分子生物学技术，基因工程领域。本发明方法为：构建目标基因的重组表达质粒；以此为模板，设计长引物片段，易错PCR扩增得到两端带有表达载体20～70bp同源序列的突变基因；分别对表达载体的与突变基因两端同源区域以及与基因组同源区域进行酶切线性化；将易错PCR扩增产物与线性化后的表达载体以一定的摩尔比混合电转化酵母，通过同源重组，外源突变目标基因整合入酵母基因组，获得基因突变文库。本方法效率高，操作方便，建库周期由1～2周缩短为3天，建库不需要任何亚克隆步骤，降低了突变基因容量与丰度的损失，具有通用性，可用于各种能在酵母中表达的目标基因。

主权项

1、一种构建酵母整合型基因突变文库的方法，其特征是基于体内同源重组，步骤为：(1)将需要突变的目标基因克隆到表达载体的多克隆位点中构建成重组表达质粒，并将重组表达质粒导入酵母进行整合性表达；(2)以重组表达质粒为模板，使用长引物进行易错PCR扩增得到上下游与表达载体有20～70bp同源序列的突变基因；(3)对表达载体的两个区域：①与突变基因两端同源区域，②与酵母基因组同源区域，进行酶切线性化；(4)将线性化表达载体按照一定的比例与易错PCR扩增产物混合，将混合物电转化酵母，由于易错PCR扩增产物两端与线性化后的表达载体两端具有同源区域，两端同源重组形成线型产物；由于线型产物两端具有与酵母基因组同源区域，根据同源区域的末端不同，外源目标基因片段插入或者双交换整合入酵母基因组中，涂布酵母筛选平板，获得基因突变文库。