[发明专利]棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法

摘要

本发明是对棉花花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法，属于生物技术领域。包括载玻片打孔做成培养花粉管的小室；将花粉在小室中培养，萌发出花粉管；培养好的花粉管用含4％多聚甲醛的50mm Pipes缓冲液(pH6.9)固定1-2h；洗涤后再置于0.1-0.2％的甘油(或0.1-0.2％浓度的Triton X-100)中室温渗透3-4h(或4℃冰箱过夜)；洗涤后用浓度为1-2.5μg/ml的TRITC(罗丹明)标记的鬼笔环肽避光染色2-4h；洗涤后在共聚焦扫描显微镜下观察。本发明操作简单，标记效果好，将在棉花花粉管细胞的骨架以及受精生殖研究中发挥重要作用，有重要的实际应用价值。

主权项

1、一种棉花花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括以下步骤：1)载玻片打孔将25. 5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔，其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；2)培养花粉管晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；将花粉洒在半固体培养基表面，半固体培养基质量比成分：0.01％硼酸、0.03％四水硝酸钙、0.02％七水硫酸镁、15％聚乙二醇8000、20％蔗糖和1％低熔点琼脂糖，pH6.2，28℃光照培养2-3h；3)荧光标记培养好的花粉管用含有质量百分浓度4％多聚甲醛、pH为6.9的50mM Pipes缓冲液室温条件下固定1—2h；用Pipes缓冲液洗涤花粉管；将花粉管置于体积比为0.1—0.2％的甘油或体积比为0.1—0.2％浓度的Triton X-100中室温渗透3—4h或4℃冰箱过夜；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；花粉管用浓度为1-2.5μg/ml的罗丹明TRITC标记的鬼笔环肽避光染色2-4h，微丝骨架被荧光标记；用pH7-9的磷酸缓冲液洗涤花粉管；荧光标记过的花粉管在共聚焦扫描显微镜下观察。