[发明专利]一种匍匐型地被菊遗传转化的方法

摘要

本发明涉及一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，属于菊花分子育种领域。以菊花品种“钟山红枫”RNA为模板扩增合成DREBa基因，克隆到T-载体，双酶切获取的DREBa基因目的片段与pCAMBIA 1301连接，而后转化农杆菌，获得含有重组质粒pCAMBIA1301-DREBa的农杆菌菌液；无菌苗叶圆片用农杆菌液侵染10min，共培养3d、脱菌培养3d、筛选培养获得具潮霉素抗性的生根苗。经PCR检测证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中。本发明首次针对匍匐型地被菊建立了其遗传转化体系，为地被菊分子育种工作提供了理论基础和实验依据，将有效推动其分子育种进程。

主权项

1、一种匍匐型地被菊遗传转化的方法，包括：1)无菌苗的获得于秋末取匍匐型地被菊脚芽，洗涤剂清洗15min，流水冲洗2h，滤纸吸干水分，无菌条件下依次用体积比为70％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4次，切取0.5cm带腋芽的茎段，接种于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA0.1mg·L-1培养基上诱导腋芽萌发，不定芽长至2cm左右时切下转入生根培养基1/2MS+生长素NAA0.1mg·L-1获得无菌苗；2)农杆菌悬浮液制备菊花‘钟山红枫’DREBa基因的克隆、植物表达载体构建与农杆菌转化①DREBa基因克隆与连接以菊花品种‘钟山红枫’RNA为模板进行RT-PCR扩增合成DREBa基因的cDNA开放阅读框ORF，扩增引物如下：BamHI正向引物：5’-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3’Kpn I反向引物：5’-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3’用琼脂糖凝胶电泳回收纯化以上RT-PCR目的产物片段872bp，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，进行LB+50mg·L-1氨苄青霉素平板培养，培养条件为37℃和16h，挑取白色克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-载体质粒，测序验证；②pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体构建与DH5α转化用BamH I和Kpn I双酶切连接到T-载体的DREBa基因，电泳回收目的片段，与用BamH I和Kpn I双酶切过的植物表达载体pCAMBIA 1301连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆接种于LB培养基进行液体培养，培养条件为37℃和16h，提取质粒，BamHI和KpnI双酶切鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒；③pCAMBIA1301-DREBa植物表达载体农杆菌转化与鉴定pCAMBIA1301-DREBa重组质粒采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取重组质粒并进行双酶切检测，经酶切验证含有pCAMBIA1301-DREBa重组质粒的农杆菌菌液则可用于下一步的叶盘侵染。添加终浓度体积比20％的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；将-80℃保存的农杆菌菌液常温化冻后于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆接种于30ml YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养温度为28℃，震荡速度200r·min-1，至农杆菌长至对数生长期即OD600为0.5时，将菌液倒入无菌离心管中，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，用等量30ml MS液体培养基重悬，备用；3)遗传转化体系建立在超净工作台上，25天苗龄的无菌苗顶端2-4片幼嫩叶片切成5mm2大小，在黑暗条件下进行下述培养：在MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1培养基上预培养3d，在上述制备的农杆菌悬浮液中侵染10min，用无菌滤纸吸干叶面菌液，放置于MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1上25℃共培养3d，转入脱菌培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1+羧苄青霉素Carb350mg·L-1上脱菌培养3d，然后转入筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1+潮霉素Hyg8mg·L-1+羧苄青霉素Carb250mg·L-1上培养至诱导出愈伤组织，之后转入低选择压的筛选培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1+潮霉素Hyg6mg·L-1+羧苄青霉素Carb150mg·L-1上继续培养至萌发不定芽点，以上黑暗培养时温度均为26±2℃，共培养时除外；切取带有不定芽点的愈伤块转入不加抗生素的再生培养基MS+细胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生长素NAA1.0mg·L-1上，在温度为26±2℃，光照时间为16h·d-1的条件下培养，待不定芽长至2.0cm左右时，切下不定芽转入生根筛选培养基1/2MS+生长素NAA 0.1mg·L-1+潮霉素Hyg7mg·L-1，获得具有潮霉素抗性的生根苗，将生根苗转入1/2MS+生长素NAA0.1mg·L-1培养基中正常生根；4)转基因植株的获得待抗性植株长出8-10片叶时，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，根据潮霉素磷酸转移酶基因HPT两端序列合成扩增反应引物Hyg-F正向序列和Hyg-R反向序列Hyg-F：5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′Hyg-R：5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′以抗性植株的DNA为模板，以Hyg-F和Hyg-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果显示抗性植株扩增出一条清晰的条带950bp，与潮霉素磷酸转移酶基因HPT核苷酸序列一致，证实外源基因已转入地被菊基因组DNA中，获得转基因植株。