[发明专利]青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程应用

摘要

本发明公开了一个青枯菌新胞外蛋白PopW的基因工程应用，属于基因工程技术领域。设计引物，以基因组DNA为模板，使用高保真pfu聚合酶扩增PopW的编码区序列，产物连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，用镍柱纯化PopW蛋白。亚细胞定位研究表明，该蛋白定位在植物的细胞壁上。在温室条件下，PopW还能诱导烟草抗烟草花叶病毒的侵染。说明PopW可诱导烟草系统获得抗性，为以后作为生物农药防治病害提供了很大的可能，具有重要的社会效益和经济效益。

主权项

1、青枯菌ZJ3721新胞外蛋白PopW的基因工程应用，包括：1)popW基因的克隆青枯菌ZJ3721在30℃条件下培养于MBG培养基，待菌株生长到对数期，按照细菌基因组提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA；设计扩增popW基因引物popW1：上游引物F：CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC Nde I下游引物R：GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG Hind III或扩增popW基因引物popW2：上游引物F：ATG TCC ATC CAGATTGATCGC下游引物R：GCCCGAGTAGGCCTTGTAG或扩增popW基因引物popW3：上游引物F：TCTAGAATGTCCATCCAGATTGATCGC Xba I下游引物R：GGATCCGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCT BamH I以基因组DNA为模板，使用高保真pfu聚合酶扩增PopW的编码区序列，扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃10min，产物切胶回收；2)PopW蛋白的表达及纯化产物切胶回收后加A后连接至中间载体酶切或直接酶切后连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体，测序鉴定，得到重组质粒pET-popW，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达，将筛选到的阳性克隆接种到含有LB液体培养基的试管中，37℃，180转/分条件下培养过夜，第二天按1∶100的比例接种到10mL LB中，按照上述条件培养3个小时，然后加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷使其终浓度为1mM，诱导培养2个小时后，在4℃下，6000转离心10分钟收集菌体，将其悬浮于20mMTris-HCl、pH8.0，加入终浓度为1mM的苯甲基磺酰氟，然后超声波破碎仪上进行菌体破碎，当菌液变澄清时，离心吸取上清，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测检测，并用镍柱纯化PopW蛋白，具体操作参照High-Affinity Ni-IDA Resin操作说明书进行，获得纯化PopW蛋白。