[发明专利]一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法

摘要

一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明首先构建了以糖化酶基因启动子调控潮霉素抗性基因表达的重组质粒pP_glaA-Hyg^R；将重组质粒pP_glaA-Hyg^R经Hind III线性化后转化黑曲霉F0410原生质体，使糖化酶基因启动子调控的潮霉素抗性基因随机整合入黑曲霉基因组中；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，获得抗潮霉素的重组黑曲霉工程菌，命名为CICIM GAH14；对CICIM GAH14采用传统诱变技术进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株。在所获得的高抗性菌株中，正突变率达到37.5％，而正突变的菌株产糖化酶水平比原始黑曲霉菌株提高8％～58.7％。

主权项

1、一种高产糖化酶工业生产菌株的选育方法，其特征是首先构建重组质粒pPglaA-HygR；将重组质粒pPglaA-HygR经Hind III线性化后转化黑曲霉F0410原生质体；用潮霉素hygromycin B筛选出转化子，命名为CICIM GAH14；对CICIMGAH14进行物理诱变，再用更高浓度的潮霉素hygromycin B进行突变株的筛选，获得高产糖化酶工业生产菌株；步骤如下：(1)根据黑曲霉F0410的糖化酶基因启动子的DNA序列SEQ ID NO：1设计引物，以含有糖化酶基因启动子的染色体DNA为模板，进行PCR扩增，得到糖化酶基因启动子；(2)将克隆载体pBlueScript SK(-)经SmaI限制酶作用后，与步骤(1)的糖化酶基因启动子在T4连接酶的作用下反应过夜，得到连接产物；(3)将步骤(2)的连接产物转化宿主菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pSK-PglaA；(4)将步骤(3)所得的重组质粒pSK-PglaA和质粒pRS303H分别经BamHI、NcoI双酶切后，胶回收813bp的PglaA片段和5108bp的载体片段，用T4连接酶连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pRS-PglaA；(5)将pRS303H采用NcoI单酶切，胶回收357bp无启动子的hphNT1基因，并将其插入pRS-PglaA的NcoI位点中，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含青霉素的LB平板，挑选阳性克隆，并进行培养，然后提取小量质粒进行酶切验证，获得重组质粒pPglaA-HygR；(6)将步骤(5)所得的重组质粒pPglaA-HygR经HindIII线性化后，以原生质体转化方法转化宿主细胞黑曲霉F0410，用100～200μg/mL潮霉素筛选出转化子，阳性转化子即为CICIM GAH14；(7)对CICIM GAH14进行传统物理诱变；(8)再用潮霉素进行突变株的筛选，在含200～2000μg/mL潮霉素的抗性平板中进行突变株的筛选，获取高产糖化酶工业生产菌株，正突变率达到37.5％，而正突变的菌株产糖化酶水平比黑曲霉F0410提高8％～58.7％。