[发明专利]一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

摘要

本发明提供一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，属植物保护领域。根据水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒核苷酸序列设计三条引物，[A]RB1_S9_F，[B]RB2_S9_F，[C]RB_S9_R，其中A/C组合检测水稻黑条矮缩病毒，B/C组合检测南方水稻黑条矮缩病毒。样品提取总RNA后，只需一次RT-PCR，即可检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒两种病毒，实现了两种病毒的鉴别。相对于传统的一次RT-PCR检测一种病毒的方法，大大减少了成本，节约了时间，是一种特异、灵敏、经济而又方便的检测方法。

主权项

一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括以下步骤：(1)引物设计：①根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez db＝nucleotide)上已报道的水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列(AB011403，AF459812，AY050486，AY050487，AJ291706，AJ297429，AJ297430，NC_003731，AF536564，AF540976，AY039705)及南方水稻黑体矮缩病毒(EU523359，EU784843)S9核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：RB1_S9_F：5`-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3`RB2_S9_F：5`-TTACAYCAAGCACTTTGCGAGG-3`RB_S9_R：5`-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3`②引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：引物组合 RT引物 检测病毒名称 目的片段大小RB1_S9_F/RB_S9_R RB_S9_R 水稻黑条矮缩病毒 1119bpRB2_S9_F/RB_S9_R RB_S9_R 南方水稻黑条矮缩病毒 569bp(2)总RNA提取：取植物样品组织0.1g，加入1mL Trizol reagent充分研磨，研磨液移入一1.5ml离心管，室温放置5min；加入氯仿200μL，混匀后静置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；12,000g，4℃，离心10min，弃去上清；加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀；干燥RNA沉淀，而后加40μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。(3)RT-PCR扩增：①反转录(RT)：取一Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 3μL，引物RB_S9_R 1μL，DEPC处理水8.5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：5×M-MuLV反转录酶缓冲液 4μLdNTPs(10mM/dNTP) 2μLRNase inhibitor(20U/μL) 0.5μLM-MuLV反转录酶(200U/μL) 1μL42℃水浴1h，70℃处理5min，-20℃保存备用。②聚合酶链式反应(PCR)：以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：反转录产物 2μL10×PCR缓冲液 2.5μLdNTP(10mM/dNTP) 0.5μLRB1_S9_F(10μmol/L) 1.5μLRB2_S9_F(10μmol/L) 1.5μLRB_S9_R(10μmol/L) 1.5μLTaqDNA聚合酶(5U/L) 0.5μLDEPC处理水 15μL总体积 25μL反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、50-55℃退火50sec、72℃延伸2min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。(4)电泳检测：取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条1119bp的核酸条带，在仅感染南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条569bp的核酸条带，在同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到569bp和1119bp两条核酸条带。