[发明专利]牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

摘要

本发明公开了牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法。该方法将嗜热脂肪芽孢杆菌经过一次活化后在生产培养基中，于50～65℃和搅拌转速为100～150rpm的条件下培养24～36h，离心后收集菌泥，加入琼脂溴甲酚紫溶液，混合均匀，使每个试剂盒的芽孢达到1.00×10⁷～2.50×10⁸cfu，于60～70℃分装入多孔反应容器，盖上铝塑膜，倒置、封口，并装入铝塑袋，防止吸潮和避光保存。该试剂盒简单易用，灵敏度高、重复性、低成本和高通量，在4～8℃条件下保存12～18个月，能检测牛奶中β-内酰胺类抗生素残留。

主权项

1、一种牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法，其特征在于包括如下步骤和工艺条件：第一步将嗜热脂肪芽孢杆菌冻干粉置于肉汤液体培养基，于45～55℃，100～150 rpm下培养24～36 h，制成母发酵剂；以重量份数计，所述肉汤培养基原料配方为：蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水94.4～96.1份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10MPa灭菌15～20 min，冷却至45～55℃备用；第二步以体积比为2～5∶100的比例，将母发酵剂接入生产培养基中，于50～65℃的发酵罐中进行培养，在培养过程用NaOH溶液调整pH为7.0～8.0，搅拌转速为100～150 rpm，培养24h～36h后收集，得发酵菌悬液；以重量份数计，所述生产培养基原料配方组成为：蛋白胨1.5～3.0份，牛肉膏为2.5～3.5份，葡萄糖为1.0～2.0份，磷酸氢二钾0.010～0.030份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.37～93.59份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10 MPa灭菌15～20 min，冷却至50～65℃备用；第三步将所述发酵菌悬液于5000～8000 rpm条件下，离心20～25 min，舍弃上清液，收集菌泥A；第四步在菌泥A中，按生理盐水与菌泥的体积比为1～5∶1加入生理盐水，混合均匀后于5000～8000 rpm条件下，离心20～25 min，舍弃上清液，收集菌泥；清洗2～3次，于5000～8000rpm条件下，离心20～25min，舍弃上清液，收集菌泥，放置4～10℃条件下48～120h，得菌泥B；第五步按琼脂指示剂溶液与所述菌泥B的体积比为1～5∶1加入琼脂指示剂溶液，于60～70℃下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.1～0.3 mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的芽孢菌达到1.00×107～2.50×108cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60～70 ℃倒置0.5 h后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒；以重量份数计，所述琼脂指示剂溶液原料配方组成为：琼脂1.5～3.0份，溴甲酚紫0.0008～0.0015份，NaOH 0.015～0.020份，蛋白胨1.0～1.5份，牛肉膏粉2.5～3.5份，氯化钠0.4～0.6份，蒸馏水91.38～94.58份；搅拌溶解均匀后用0.08～0.10 MPa灭菌15～20min，冷却至60～70℃备用；所述每孔或微量反应器中的配方组成为：琼脂1.5～1 5.0 mg，溴甲酚紫0.8～7.5μg，NaOH 15～100μg，蛋白胨1.0～7.5 mg，牛肉膏粉2.5～17.5 mg，氯化钠0.4～3.0 mg，蒸馏水94.38～472.90 mg，芽孢菌数为1.00× 107～2.50× 108cfu；第六步在所述第五步的试剂盒每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.05～0.25 mL，用铝塑膜仔细密封，于60～65℃的水浴或恒温箱中恒温反应2小时15分～2小时45分，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.2～6.8，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。