[发明专利]检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒

摘要

一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括ELISA抗原预包被板条、洗涤液、100倍浓缩的酶标抗原、酶标稀释液、底物显色液、终止液及标准PCV2阴、阳性血清。本试剂盒采用酶标抗原代替酶标抗抗体，酶标抗原不会与非特异性吸附于ELISA板的抗体结合，同时待检测血清标本不需预先稀释，直接与工作浓度的酶标抗原混合后即可直接用于测定，操作简单，所需检测时间更少。

主权项

1、一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依双抗原夹心ELISA原理研制而成，包括：a.ELISA板条：每个试剂盒包含4块真空包装的ELISA板，每块板含可拆卸的已包被检测抗原的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；该包被抗原是依据GenBank中PCV2的基因序列(登录号：AY943819)，设计两条引物，上游引物为：GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物为：GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通过PCR的方法从猪PCV2基因组中扩增不含核定位信号的Cap基因，将其克隆到pET32-a(+)原核表达载体中，构建pET32a-Cap重组表达载体；转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，参照Novagen公司pET Syetem Manual表达重组Cap融合蛋白，用亲和层析法纯化表达的融合蛋白制得；b.洗涤液：10倍浓缩的pH为7.4的含0.5％(体积百分比)吐温-20的1M PBS溶液200ml；c.100倍浓缩的酶标抗原500μl：将上述纯化的Cap融合蛋白用猪源肠激酶酶切去掉融合部分，并再次使用亲和层析柱纯化获得不含核内化信号肽的Cap蛋白，并用超滤管将其浓缩至2.0mg/ml，并采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶偶联于Cap蛋白上；d.酶标稀释液：pH为7.4的0.1M PBS溶液50ml；e.底物显色液50ml：称取200mg四甲基联苯胺，用100ml无水乙醇或DMSO溶解后，以双蒸水定容至1000ml，配置显色液A；称取9.33g柠檬酸，14.6g磷酸氢二钠，加入0.75％(质量体积比)的过氧化氢尿素6.4ml，调pH值到5.0～5.4，双蒸水定容至1000ml，配制显色液B；显色液A、B等体积混合，即为显色剂；量取111.2ml18M浓硫酸稀释定容至1000ml即用；f.终止液：2M硫酸溶液50ml；g.标准PCV2阴、阳性血清各1.0ml。