[发明专利]一种检测鱼类精子质膜损伤的方法

摘要

一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，涉及水产养殖技术，需要提供一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，本发明采集鱼类精子，其特征是将精子收集到10mL的离心管中，加入2uL胰蛋白酶消化5min，用缓冲液洗涤重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×105·mL-1；取195μL精子悬液，加入5μLAnn-FITC，在室温下孵化，然后加入10μLPI染液，室温下避光孵育10-15min；通过采用荧光双染法对受到不同损伤的精子进行染色，经过前处理后直接用流式细胞分析仪进行检测，可定量区分质膜完整的精子和质膜不完整的精子。

主权项

一种检测鱼类精子质膜损伤的方法，采集一定数量的鱼类精子，其特征是将精子收集到10mL的离心管中，800×g离心5min，弃去上清液，用缓冲液稀释，使待测样本精子数为(2～3)×105·mL-1；加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800×g离心5min，再用缓冲液重新悬浮精子，使精子细胞浓度为1-2×105·mL-1；取195μL精子悬液，加入5μLAnn-FITC，在室温下孵化10min，然后加入10μL PI染液，室温下避光孵育10-15min；利用FACSCalibur型流式细胞仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mw；用Cel-lquest 9.3版检测每个精子的前向角散光和侧向角散光；用波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于610nm的滤器检测PI；将Annexin V标记上荧光素作为探针检测暴露在质膜外侧的磷脂酰丝氨酸；同时结合使用碘化吡啶PI进行双染色后，用流式细胞仪检测质膜完整的正常活精子、质膜损伤的凋亡精子及质膜完全破裂的坏死精子。