[发明专利]荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法及其试剂盒

摘要

本发明公开了一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法的荧光PCR反应体系中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为100nM；在PCR反应前测定反应前荧光值；在PCR反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用公式VL＝2-(CtHPV-CtHMBS)算出相对病毒载量值，并根据相对病毒载量值判定是否HPV感染阳性。该方法可简单快速的对HPV感染进行相对定量的检测。本发明还提供了一种用于该方法的试剂盒，使用本试剂盒可以准确、快速、特异和方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。

主权项

一种荧光定量PCR定性检测高危型HPV的方法，该方法依次包括如下步骤：A)根据待检测的HPV基因的特异性核酸序列分别合成13对引物，上下游引物之间相距50～200个碱基；B)并根据各型HPV基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列分别设计、合成Taqman荧光探针；、C)使用步骤A)中的引物和步骤B)中的荧光探针荧光反应体系，其中镁离子的浓度为1～10mM，Taq聚合酶0.1～5U，各种引物及探针浓度为10～500nM；D)从待测临床标本中提取DNA，取适量加入步骤C)中的反应体系中，经离心混合后将反应管放入实时定量PCR反应仪，进行20～50次循环扩增反应，反应结束后测定反应管中的荧光增值；E)同时用系列阳性和阴性模板也进行D)的核酸提取反应，测得各自相应的代表荧光增值的循环数(Ct值)，根据Ct值算出目的基因相对含量(算法详见后述)，并将其相对于阳性模板的初始核酸量做图，制作标准曲线；F)用上述步骤中获得的各样品Ct值计算得出的目的基因的相对含量即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。