[发明专利]一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法

摘要

本发明涉及一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：(1)草酸+草酸脱羧酶+醋酸缓冲溶液，20～37℃，反应30～60min；(2)配制pH7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、苹果酸脱氢酶的Tris-HCl缓冲液，37℃温育，380nm处测A1；(3)在步骤2中添加步骤1反应液，37℃反应5min，380nm处测A2及A3；(4)根据ΔA380nm＝ΔA待测－ΔA空白计算NADH减少量，再根据反应原理计算生成二氧化碳的浓度，从而计算草酸脱羧酶的浓度。该方法操作简便，所用的酶试剂较便宜，成本低，灵敏度高，与其它市售的测定草酸的试剂盒相比精确度相近，有很好的实用性。

主权项

1.一种通过酶法测定二氧化碳浓度来确定草酸浓度的方法，包括：(1)第一步反应酶催化反应体系的构建空白样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL失活的草酸脱羧酶，混合备用；待测样品的准备：量取0.3mL 200mmol/L醋酸缓冲液，0.1mL草酸及0.1mL酶活＞0.8U/mL的草酸脱羧酶，混合备用；第一步反应酶催化反应体系总体积V₂为0.5mL，反应pH为3.0-5.5，反应温度为20-37℃，反应时间为30-60min；(2)第二反应体系分别准备2管各1mL的CO₂测定试剂，于37℃温育5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得A₁；其中CO₂测定试剂的组成：8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM NADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和大于200-300U/L的苹果酸脱氢酶，66-100mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3～8.5；(3)第三反应体系空白样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应空白样品液V₃；待测样品组：混合1mL CO₂测定试剂和0.01～0.05ml第一步反应酶催化反应待测样品液V₃；第三反应体系总体积V₁为1mL+V₃，37℃，5min，pH 7.3～8.5，380nm条件下测得空白组A₂及待测组A₃；(4)计算草酸浓度mmol/L公式(1)其中，V₁——最后的反应液总体积(mL)v——加入待测样草酸体积(mL)V₂——第一步酶反应液总体积(mL)V₃——第三步参加酶反应液的体积(mL)d——比色皿光径(cm)ε₁——NADH的吸收系数：1.33L·mmol^-1·cm^-1，在380nm处ΔA_380nm＝ΔA_待测-ΔA_空白；ΔA_空白＝A₂-A₁，ΔA_待测＝A₃-A₁。