[发明专利]一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法

摘要

本发明涉及一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者血清样本，进行血清HBV DNA的抽提，对乙型肝炎病毒P基因区进行检测，相应位点特异性引物的设计以及用于序列测定的实验方案、试剂以及报告生成系统，通过同时检测分析个体的HBV P基因区9个位点的基因型来识别乙型肝炎病毒核苷酸类药物的耐药性。本发明的优点是可用于乙型肝炎患者核苷酸类药物的应用。

主权项

1、一种用于识别乙型肝炎病毒耐药性的检测方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1.采集被测者血清样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提步骤1中的被测者血清样本中的HBV DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测；步骤3.基因突变检测：将每一个被测者的HBV DNA样本放入1个反应孔，检测HBV P基因区，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术进行基因突变检测：步骤3-1，反应体系配置：在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的正向引物和反向引物浓度皆为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，步骤2得到的20ng/μl的被测者血清样本中的HBV DNA模板3μl，去离子水11.2ul；检测HBV P基因DNA 301-1200正向引物和反向引物如下：正向引物：ttcctcttcatcctgctgct反向引物：gttggcgagaaagtgaaagc步骤3-2，采用PCR技术进行扩增：将1个反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；步骤3-3，将1个反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即可进入下一步；a.1wt％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bp DNA标记物5ul；c.PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；d.电泳电压：120v；e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图，30min拍摄一张电泳图；步骤3-4，纯化：终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP+PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul、去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON1 0.125ul、步骤3-3得到的PCR产物3ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；4℃恒温保存；步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪：步骤3-5-1，从-20度冰箱中取出步骤3-4得到的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，测序引物：ttcctcttcatcctgctgct；步骤3-5-2，记录日期、PCR纯化产物名、测序引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；步骤3-5-3，取一块反应板，标上DNA模板名、测序引物名、日期；步骤3-5-4，每个样本做一个PCR反应，用一个反应孔；步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸；步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70wt％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；步骤3-5-11，每孔加入8ul的95wt％甲酰胺与ddH2O混合物；步骤3-5-12，在ABI 3730上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：9个位点各有2种结果，即正常结果和突变结果；步骤4.结果分析：(1).未检出突变：您的检测结果中未发现HBV P基因区突变位点；(2).检出突变：您的检测结果中存在与HBV核苷酸类药物耐药相关的突变位点。