[发明专利]一种外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法

摘要

本发明涉及一种外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法。本发明用特征性引物合成结合DNA，与从鱼肝脏中提取的壬基酚受体及不同浓度的壬基酚结合形成复合物后，经核酸外切酶III和S1核酸酶消解，使游离的DNA不能被扩增；酶切后的产物作为模板，进行荧光定量PCR扩增，得到加入壬基酚浓度与起始模板拷贝数的回归方程，结合定量DNA标准曲线，经线性回归分析，得到壬基酚浓度与Ct值关系，进行不同浓度壬基酚的检测。本发明具有灵敏度高，检出限低的特点，可用于快速检测大批量样本中的壬基酚含量。

主权项

一种外切酶保护荧光定量PCR检测壬基酚的方法，包括如下步骤：(1)含受体细胞溶质的提取：取经过一个月壬基酚暴露喂养后的金鱼，用5mg/L的苯坐卡因麻醉。取出肝脏，用0.15mol/L冰上预冷的KCl溶液洗去肝脏外血液，再用灭过菌的滤纸吸干表面水分，按照肝脏m∶缓冲液v＝1∶4比例加入冰上预冷的HEDG缓冲液于玻璃匀浆器中匀浆；匀浆液于12000g离心20min，收集上清。再于16000g离心1小时，小心吸取上清，即为含有受体的细胞溶质，分装后于-80℃保存备用；(2)结合DNA的制备：将pUC19质粒稀释50倍作为模板，常规PCR方法扩增制得结合DNA；产物于1％琼脂糖凝胶电泳分离，用PCR产物快速纯化试剂盒纯化回收；(3)受体-配体结合：将1g/L的壬基酚按10倍比稀释为0.1g/L-1ng/L，各取10μl，加入上述提取的细胞溶质250μl，于20℃振荡温育2h；(4)受体-配体-结合DNA复合物的制备：从上述每管中取出20μl于1.5mlEP管中，加入1μg poly(dI.dC)于20℃温育15min后，再加入2μl结合DNA，继续20℃温育15min，此时溶液中为受体配体DNA复合物；(5)外切酶消解：按照6∶1∶3体积比例向复合物中加入ExoIII buffer和HEDG缓冲液，混匀后37℃温育15min；每20μl再加入ExoIII 100U，混匀后于37℃温育15min；取出5μl酶切产物，加入S1量为50U的15μl S1混合液，37℃温育30min；再加入1μlS1停止液，70℃灭活10min；得到荧光定量PCR的模板；(6)荧光定量PCR扩增：每20μl体系中包含有SYBR Green I Master mix10μl，浓度为10μmol/L的引物R1 1μl，浓度为10μmol/L的引物R2 1μl，模板2.5μl，灭菌双蒸水5.5μl；荧光定量PCR循环步骤：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；最后在72℃延伸5min；(7)建立荧光定量PCR检测壬基酚标准曲线；(8)根据标准曲线，经线性回归分析，得到壬基酚浓度与Ct值关系，进行不同浓度壬基酚的检测。