[发明专利]一种α-氨基酸酯水解酶制备非均相生物催化剂的方法

摘要

本发明涉及一种α-氨基酸酯水解酶制备非均相生物催化剂的方法。本发明公开了一种氨基头孢菌素类和氨基青霉素类酶法合成用生物催化剂的制备，本发明α-氨基酸酯酶的分离使用红纹黄单胞菌菌丝体细胞；通过革除冷冻预处理步骤，用乙酸丁酯进行细胞破碎程序，接着在相应的优化条件下进行酶的提取；使用天然未冷冻的菌丝体细胞得到了高纯度的无细胞提取液(比酶活5.5-9.5U/mg蛋白)，蛋白聚集体以及最终得到的生物催化剂中α-氨基酸酯酶含量高，从而确保能生产出高活性的非均相生物催化剂(2400-3600U/g干重)；本发明的生物催化剂可用于氨基头孢菌素类和氨基青霉素类的合成。

主权项

一种α-氨基酸酯水解酶制备非均相生物催化剂的方法，其步骤如下：1)取VKPM B-9915或CGMCC No.2339菌株的菌丝体细胞不做冷冻处理而直接悬浮于Tris-HCl缓冲液中，加入巯基乙醇以稳定酶；2)加入乙酸丁酯破碎菌丝体细胞，加热，将反应器温度维持在30℃，控制初始pH值不得高于pH8.0，在反应过程中pH值会下降，在下降到pH7.1时，滴加12.5％氨溶液以维持pH 7.1±0.1，6-7小时50分钟后，氨溶液的消耗速度与初始值比较降低1.8-2.0倍时，酶提取过程完成；3)将酶提取液快速冷却至15-20℃，加入絮凝剂，离心分离破碎的菌丝体细胞，得无细胞提取液，残渣用乙酸钠缓冲液洗涤，洗涤液离心分出，并入无细胞提取液中，调节pH到6.8-7.2范围内；4)把无细胞提取液加入反应器，冷却至2-4℃，加聚乙二醇到无细胞提取液中，搅拌15分钟，再加入25％戊二醛水溶液反应混合物在2-4℃下轻微摇动，孵化2小时，将制得的固体颗粒减压滤出，洗涤至滤液无色制得交联蛋白(酶)聚集体形态的湿的无载体非均相生物催化剂。