[发明专利]一种新型的基因突变重组方法及其应用

摘要

本发明属于基因工程领域，涉及到一种基因突变重组的方法以及在蛋白质(酶)基因突变文库建立中的应用。在扩增目标序列的聚合酶链式反应(PCR)体系中，通过PCR反应将核苷酸类似物2-脱氧次黄嘌呤核苷-5-三磷酸(dITP)随机掺入到靶基因序列中从而产生多点随机突变，利用特异识别切割dITP的内切核酸酶V(endo V)将扩增的目标基因序列片段化，然后利用无引物PCR将获得的突变目标基因小片段进行延伸和重组装，最后获得重新组装的目标基因的突变基因库。本发明提供的方法克服了传统DNA改组(DNA shuffling)方法利用核酸内切酶I(DNase I)随机切割目标序列过程中不易控制，费时费力等不足，可广泛应用于各种蛋白质(酶)编码基因的随机突变文库的构建。

主权项

1、一种新的基因突变重组方法，包括目标序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增，酶切片段化，基于PCR的序列延伸和组装，其特征是：(a)将一种核苷酸类似物2-脱氧次黄嘌呤核苷-5-三磷酸(dITP)加入扩增目标基因片段的PCR反应体系中，在PCR反应的延伸步骤中，体系中的dITP能够掺入到扩增的目标基因序列中，从而获得包含dITP的多点随机突变的目标基因；(b)利用特异识别dITP的内切核酸酶endoV酶切步骤(a)获得的突变基因序列使之片段化；(c)将获得的片段化的随机突变基因片段经过无引物的PCR延伸和组装，最后获得具有重新组装的突变基因库，以备筛选新的突变体蛋白质；(d)利用目标基因序列特异性引物，对从步骤(C)获得的重新组装的突变基因进行常规的PCR扩增，从而对突变文库进行重新放大，提高文库中随机突变基因的数目。