[发明专利]魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法

摘要

本发明公开了一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是：首先合成1对扩增DsMV的cp基因中间部分核心序列的寡核苷酸引物；然后将提取的魔芋叶片的总RNA反转成cDNA，再以cDNA为模板，结果扩增得到了与预期大小一致的0.35kb片段，接种后感病毒的魔芋叶片也扩增到了此片段，而对照中未扩增到任何产物。本方法在分子水平上为魔芋中DsMV的检测提供了一种快速、灵敏、简便的新方法，为魔芋中DsMV的防治、脱毒苗的检测提供了有效手段。

主权项

1、一种魔芋中芋花叶病毒分子快速检测方法，其步骤是：A、合成DsMV检测的特异性引物DF：5′-GGG CTT GGG TGA TGA TGG A-3′，DR：5′-GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG-3′，目的片段长度0.35kb；B、用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取带芋花叶病毒的魔芋叶片总RNA；C、取一微量离心管，加入提取的RNA 8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下变性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入：反转录酶缓冲液8μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制剂1μL，20U/μL的反转录酶2μL，0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯处理过的重蒸水15μL，将反应混合物于42℃ PCR仪中延伸1h，-20℃保存备用；D、在12.5μLPCR反应体系中，取上述反转录产物complement DNA 2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸碱基脱氧核苷酸0.8μL，反转录酶缓冲液2μL，20mMol的氯化镁0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反应条件是94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后再72℃延伸5min，在PCR仪上扩增；E、取扩增产物2.5μL进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测到0.35kb片段长度条带的为带病毒植株，无条带的为健康植株。