[发明专利]安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用

摘要

本发明提出一种安哥拉糖胺合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建及其应用，是以链霉菌基因组文库质粒为模板，通过PCR扩增6个安哥拉糖胺合成酶基因及其糖基转移酶基因，将其依次连接并置于链霉菌启动子P_actIII-actI下游，形成一个转录元；将转录元转移到链霉菌质粒载体pSET152上，构建了多基因共表达的链霉菌表达质粒pAYT55；将pAYT55导入宿主细胞天蓝色链霉菌CH999，得到的工程菌与积累聚酮抗生素(kalafungin)的链霉菌B135进行混合培养，能实现kalafungin的生物转化，变成带有安哥拉糖胺的新抗生素；或者将pAYT55直接导入链霉菌B135，单独培养实现kalafungin的糖基化。所以，利用这套系统可以在胞内合成稀有的安哥拉糖胺，并利用抗生素糖基转移酶的低底物识别特异性对聚酮抗生素进行安哥拉糖胺的修饰。

主权项

1、一种安哥拉糖胺糖基合成酶及糖基转移酶多基因共表达系统的构建，它是以现有基因资源含安哥拉糖胺合成酶和转移酶基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，分别进行PCR扩增，其特征在于扩增得到6个med-ORF20，18，17，16，15和14的糖基合成酶基因和一个med-ORF8的糖基转移酶基因，将经测序正确的7个基因依次连接并插入到过渡载体pNEB193J的高效启动子PactIII-actI下游，然后从得到的质粒上切下包含7个基因及上游启动区域的9kb表达盒片段，插入到链霉菌质粒pSET152上，获得一个链霉菌多基因共表达质粒pAYT55；然后通过原生质体转化，将pAYT55导入常用的链霉菌表达细胞天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)CH999中，构建多基因共表达系统工程菌CH999/pAYT55，保藏号为CCTCC No：209160；或者通过原生质体转化，将pAYT55导入能产生芳香聚酮抗生素Kalafungin的链霉菌细胞(Streptomycescoelicolor)B135菌株中，构建多基因共表达系统工程菌B135/pAYT55，保藏号为CCTCC No：209159。