[发明专利]一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得β－聚苹果酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用普鲁兰酶有效降解去除出芽短梗霉发酵液中普鲁兰多糖，以利于提取获得β-聚苹果酸的方法。利用本方法能够有效降解去除出芽短梗霉发酵液中的普鲁兰多糖，提高产物产率和纯度，避免由于普鲁兰多糖的干扰而造成的一系列繁琐操作，提高了工作效率，降低产物生产成本。本发明通过下述方案予以实现：将出芽短梗霉菌种经活化和种子培养后接种于发酵培养基中；在24～30℃和120～200r/m条件下培养7d～12d，发酵结束后，取发酵液经5000r/m离心或过滤，除去菌体。发酵过滤液(上清液)调节pH至pH5～pH 7，添加普鲁兰酶6～11plu/mL上清液，在30℃～50℃条件下，反应30min～90min，随后添加无水甲醇至甲醇终浓度为40％～60％，缓慢搅拌后静置过夜，获得的沉淀即为β-聚苹果酸粗品，将β-聚苹果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，经5000r/m离心，除去小分子不溶物，真空浓缩后冷冻干燥得β-聚苹果酸。

主权项

1.利用酶法去除普鲁兰糖获得β-聚苹果酸的制备方法，包括以下步骤：第一步培养基的配制(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；(3)发酵培养基：葡萄糖12％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO33％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；第二步菌种活化将斜面菌种——出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan)转接PDA培养基，25℃活化培养3d～5d；第三步种子培养将第二步活化的斜面菌种接种于装有100mL第一步制得的种子培养基的500mL三角瓶中，在24～30℃，120～180r/m下培养48～90h；第四步发酵培养将第三步制得的种子培养液以8％～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在24℃～30℃，200r/m下培养7d～12d；第五步分离提取(1)普鲁兰多糖的降解：在第四步发酵结束后取发酵液，离心或过滤除去菌体，发酵过滤液(上清液)调节pH 5～7，添加普鲁兰酶6～11plu/mL，在30℃～60℃下，缓慢搅拌，反应60min～90min；(2)β-聚苹果酸的提取：将第五步(1)中的发酵液冷却至室温，缓慢搅拌，加入无水甲醇使酶解后的发酵过滤液中甲醇终浓度为40％～60％(v/v)，将该混合液于室温下缓慢搅拌后放置过夜，获得的沉淀即为β-聚苹果酸粗品，将β-聚苹果酸粗品按1∶10(m∶v)溶于蒸馏水中，经5000r/m离心，除去小分子不溶物，真空浓缩后冷冻干燥得β-聚苹果酸。