[发明专利]果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺

摘要

本发明涉及果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达生产工艺，通过对该蛋白N端和C端的测序结果，设计并合成出相应的探针从采用SMART技术构建的cDNA文库中筛选出编码该蛋白的基因，经过对其进行密码子偏爱性以及核糖体结合位点的改造，将tb1基因和pPIC9载体相连接构建pPIC9-tb1表达载体，将此表达载体通过电击转化方式转入GS115毕赤酵母表达宿主菌，构建重组毕赤酵母工程菌，将其在毕赤酵母中表达，通过对发酵条件的优化确定甘油添加量为4％，YNB添加量为1.25％，培养基pH6.0，甲醇诱导浓度1％，发酵时间84h的最佳发酵条件。本方法获得rd-1蛋白具有较高的抗肿瘤生物活性毒副作用小可作为抗肿瘤药物及保健品的主要成分。

主权项

果蝇抗肿瘤活性蛋白rd-1的高效异源表达工艺其特征在于它是通过下述步骤实现的：(1)通过SepharoseCL-4B亲和层析柱，并运用0.2M D-半乳糖进行洗脱提取rd-1蛋白并对N端和C端测序；(2)根据测序结果设计并合成简并引物或核酸探针；(3)采用SMART方法构建果蝇蛹cDNA文库；(4)通过PCR方法或核酸杂交方法从果蝇蛹cDNA文库获得rd-1蛋白全基因；(5)将rd-1基因和表达载体连接构建重组表达载体；(6)将重组表达载体转入毕赤酵母进行异源表达；(7)对重组比赤脚酵母进行发酵条件优化以期得到高水平的表达，确定最优发酵条件为甘油添加量为4％，YNB添加量为1.25％，培养基pH6.0，甲醇诱导浓度1％，发酵时间84h；上述步骤(7)得到的发酵液上清离心取上清，并进行凝胶柱分离，去除发酵液中少量杂蛋白，最终通过冷冻干燥技术制成rd-1蛋白冻干粉。