[发明专利]乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用

摘要

本发明涉及一种乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用，采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖；利用人胎肝干细胞用于体外感染模型的构建方法进行抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价。其优点是：人胎肝干细胞可感染乙型肝炎病毒并持续性的分泌乙型肝炎病毒；人胎肝干细胞可以传代培养；方法简便；重复性好。

主权项

一种乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，它包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞和验证乙肝病毒已感染细胞且病毒已繁殖，其特征在于：本发明采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖：I.分离培养人胎肝干细胞：(1).人胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏-剥离肝细胞悬液-过滤-充分散开细胞-离心细胞悬液-弃掉上清液-沉淀的细胞用培养基悬浮-将细胞放入离心管中-置于冰上沉淀-利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀-去除细胞悬液-离心沉淀细胞-细胞用PBS液悬浮-用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度-离心并吸取位于不同Percoll之间细胞层悬浮沉淀的细胞-接种于塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液-并在37℃、5％CO2孵箱中培养过夜，新分离的细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力；(2).人胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3-5天换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底。质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。II.免疫组化鉴定人胎肝干细胞：采用SP免疫组化试剂盒检测AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面标志，以PBS代替各表面标志的一抗作为阴性对照，步骤如下：消化细胞后低速离心，PBS悬起细胞-接种于盖玻片上-通风晾干-PBS充分洗涤-抗原热修复-PBS洗涤多次后呈红棕色染色为阳性-苏木素复染；III.乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞：将HBV(107-108Copies)血清接种到无血清培养液的六孔板胎肝干细胞中；孵育后，吸取上清液，采用培养液培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV。IV.采用以下三种方法验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖：(1).荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度；(2).ELISA检测不同时间细胞上清中病毒HBsAg分泌情况：采用乙肝病毒s抗原检测试剂盒对不同时间细胞上清进行HBsAg的检测；(3).原位杂交检测细胞内病毒：将感染病毒的细胞，于病毒洗去后第三天和第七天进行生物素(POD)和荧光探针标记原位杂交。