[发明专利]一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物

摘要

一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法及所用到的特异性引物，它涉及一种细菌的快速分离方法及所用到的引物。它解决了现有厌氧反硝化细菌的分离周期长、工作量大和不易获得目的功能菌株和纯菌株的问题。方法：一、提取样品中微生物DNA进行PCR扩增，分离培养，初筛出厌氧反硝化细菌；二、制备特异性培养基进行纯化至长出菌落；三、菌落富集培养，进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、重复分离、纯化和富集培养，鉴定再进行PCR扩增去除重复菌株，然后重复分离和纯化培养至获得纯菌株。上游引物为SEQID NO：1，下游引物为SEQ ID NO：2。本发明分离周期缩短了40％～50％，工作量小，容易获得目的菌株和纯菌株。

主权项

1、一种厌氧反硝化细菌的快速分离方法，其特征在于厌氧反硝化细菌的快速分离方法按以下步骤实现：一、采用DNA抽提试剂盒提取样品中微生物的DNA，然后采用特异性引物对DNA进行PCR扩增，选择含有厌氧反硝化细菌的样品，然后接种于厌氧菌液态培养基中，采用Hungate厌氧操作技术进行厌氧反硝化细菌的分离培养，然后对分离培养得到的菌进行检验，初筛出厌氧反硝化细菌；二、将初筛得到的厌氧反硝化细菌接种于厌氧菌固体培养基中，制成滚管进行厌氧反硝化细菌的纯化培养至长出菌落；三、在厌氧工作箱中挑取单菌落接种于厌氧菌液体培养基中进行富集培养7～14天得菌液，然后采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，复筛出厌氧反硝化细菌；四、对复筛得到的厌氧反硝化细菌的菌液，依次进行分离培养、纯化培养和富集培养，然后对富集培养的菌液进行镜鉴和革兰氏染色，再采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，去除重复菌株，然后重复操作分离培养和纯化培养至获得纯菌株，即完成厌氧反硝化细菌的快速分离；其中步骤一中PCR扩增程序为94℃预热5min、94℃变性30s、55.9℃复性45s、72℃延伸90s、循环30次和72℃延伸10min；步骤一中特异性引物为上游特异性引物5’-GC[T/C][C/T]ACCAAG[G/C]CGACGATC-3’，下游特异性引物5’-ACCAGGGTATCTAATCCTG-3’；步骤一中PCR扩增的反应体系如下：10×PCR Buffer 2μLdNTPs(0. 3mmol/L) 2μL上游引物(0. 1μmol/L) 1μL下游引物(0. 1μmol/L) 1μLrTaq E(0. 3U/μL) 0.3μLDNA样品(2μg/L) 2μL补足dH2O 至20μL；步骤一中厌氧菌液态培养基由2.0g的KNO3、2.0g的NaNO3，0.03g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH2PO4、0.5g的FeCl2·6H2O、0.2g的CaCl2·2H2O和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤二中厌氧菌固体培养基由2.0g的KNO3、2.0g的NaNO3、0.03g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、10g的酒石酸钾钠、1.0g的KH2PO4、0.5g的FeCl2·6H2O、0.2g的CaCl2·2H2O、12g琼脂粉和1750mL的蒸馏水组成，pH＝7.5；步骤一和步骤三中厌氧菌液态培养基成分相同；步骤三和步骤四中采用特异性引物对菌液中细菌的DNA进行PCR扩增，采用的方法与步骤一中的相同。