[发明专利]酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法

摘要

本发明涉及利用酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，属于生物技术领域。用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，干燥纸片，将干燥后的奶样纸片称重剪碎置于提取管，加入二氯甲烷充分浸泡，震荡30min，将提取液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重，向提取的标本中加入500μl含有0.1％BSA的浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗制成ELISA工作液，按照ELISA程序进行检测。本发明方法孕酮检测灵敏度达到2.1pg/孔，回收率89％；雌二醇检测灵敏度达到1.7pg/孔，回收率92％，特异性强，稳定性好。

主权项

1、酶免法测定纸片奶样生殖激素浓度的方法，包括：1)奶样采集：用相同大小的滤纸片采集尾乳，纸片应饱和浸润奶样，纸片烘干置于干燥器内；2)滤纸片奶样制样：将干燥后的奶样纸片称重w₁，剪碎置于抽提管，加入二氯甲烷充分浸泡，震荡30min，将抽提液转移到玻璃器皿内，置于干燥箱内40℃干燥脱水，同时收集碎纸片干燥称重w₂，向抽提液标本中加500μl含有质量体积比为0.1％BSA、浓度为0.01M、pH7.0的磷酸盐缓冲液润洗，制成ELISA工作液；3)包被抗体：用包被缓冲液将抗孕酮或抗雌二醇的抗体按照产品说明书稀释成包被工作液，在已编号的载体板各孔内，第1列第A、B、C排的3孔作为对照组除外，加抗孕酮或抗雌二醇IgG稀释液100μl，加盖，4℃冰箱中静置24～48小时，包被缓冲液按200ml配制：Na₂CO₃0.318g、NaHCO₃0.586g、H₂O200ml；4)洗涤：取出反应板，甩掉包被缓冲液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干，洗涤液按1000ml配制：500μl吐温20、H₂O1000ml；5)加样：在包被板A排第2～12列和F排第1～12列各孔内依次加稀释后的待测样本100μl；B和C排重复A排加样，G和H排重复F排加样；D和E排按照浓度低至高的顺序依次加标准抗原，每个梯度重复3次；6)加酶标物：加样后，将板置于4℃冰箱中，配制酶标物，取出载体板，在各孔内加酶标物100μl，置37℃培养箱中反应2小时；7)洗涤：取出反应板，甩掉反应板的反应液，用洗涤液洗涤3次，吸水纸吸干；8)加底物液：配制底物液，在各孔内加底物液200μl，室温避光反应30min，此时反应液呈蓝色；底物液按20.25ml配制：TMB250μl、过氧化脲2ml、H₂O18ml；9)加终止液：各孔加终止液50μl，此时反应液呈黄色，终止液按6ml配制：浓硫酸∶水＝1∶9，浓硫酸600μl、水5.4ml；10)读取OD值：用酶标仪在450nm波长处读取各孔的光密度值；11)OD值到浓度的换算：(1)以标准孕酮或雌二醇的浓度为横座标，结合率为纵座标，绘制标准曲线，待测样本的结合率在标准曲线横座标上所对应的值乘以样本稀释倍数，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；(2)或者将标准曲线直线化：设孕酮或雌二醇浓度为X，结合率为y，可得回归方程y＝A+Blogx，即可求得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；(3)或者直接使用curxpt软件建立标准曲线，进行结合率与浓度的换算；即得待测样本的孕酮或雌二醇含量pg/100μl工作液；12)激素浓度定量计算：(1)pg激素/片奶样：(2)或者ng激素/ml奶样：根据抽提前后纸片重量差Δw＝w₁-w₂，牛奶干物质含量取12.5％，比重取1.02，换算得到生殖激素质量体积浓度：