[发明专利]一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种用于构建hpRNA的载体、构建方法及其应用。本发明提供的DNA片段，自上游至下游依次包括启动子、DNA片段A、loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和终止子；DNA片段A依次由LIC处理单核苷酸终止位点，LIC1片段、限制性内切酶A识别位点、与LIC3片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；DNA片段B依次由LIC处理单核苷酸终止位点、LIC2片段和限制性内切酶B识别位点组成；DNA片段C依次由限制性内切酶C识别位点、与LIC4片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成。应用本发明的DNA片段构建hpRNA载体，只需进行一步克隆，大大提升了构建的效率，节约了成本，几乎100％阳性，表现出良好的性能及稳定性，可以在顺式表达水平以及转基因水平中获得有效转录后基因沉默。

主权项

1、一种表达盒，为双链互补的DNA片段，从启动子到终止子转录方向定义为5′→3′方向，依次包括：启动子、DNA片段A、20个以上脱氧核糖核苷酸组成的loop核苷酸序列、DNA片段B、DNA片段C和终止子；所述DNA片段A的5′→3′的链，自上游至下游依次由LIC处理单核苷酸终止位点，LIC1片段、限制性内切酶A识别位点、与LIC3片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，自上游至下游依次由LIC处理单核苷酸终止位点、LIC2片段和限制性内切酶B识别位点组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，自上游至下游依次由限制性内切酶C识别位点、与LIC4片段反向互补的脱氧核糖核苷酸组成的片段和LIC处理单核苷酸终止位点互补位点组成；所述LIC1片段、LIC2片段、LIC3片段和LIC4片段均由12至50个脱氧核糖核苷酸组成；所述LIC处理单核苷酸终止位点为A、T、C和G这四种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补的一个脱氧核糖核苷酸；所述DNA片段A满足如下(I)或(II)或(III)的条件：(I)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(II)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(III)所述DNA片段A被所述限制性内切酶A酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段A的3′→5′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述DNA片段A的5′→3′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段A的5′→3′的链，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段B满足如下(IV)或(V)或(VI)的条件：(IV)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(V)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述3’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(VI)所述DNA片段B被所述限制性内切酶B酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段B的3′→5′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段B的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点外，所述切割位点的上游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；所述DNA片段C满足如下(VIII)或(VIII)或(IX)的条件：(VII)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生平末端；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(VIII)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生3’粘性末端；所述3’粘性末端的突出核苷酸序列由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成；(IX)所述DNA片段C被所述限制性内切酶C酶切后，在切割位点处产生5’粘性末端；所述DNA片段C的5′→3′的链，所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸为与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的任意一个脱氧核糖核苷酸；所述5’粘性末端的突出核苷酸序列中，除了5′→3′最后一位脱氧核糖核苷酸外，由任意脱氧核糖核苷酸组成；所述DNA片段C的5′→3′的链，除了所述5’粘性末端的突出核苷酸和所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点外，所述切割位点的下游序列由与所述LIC处理单核苷酸终止位点互补位点不同的剩余三种脱氧核糖核苷酸中的至少一种组成。