[发明专利]以家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种以家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法，主要包括以下步骤：以蝎cDNA为模板、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCTATGGATGGATATATAAG-3′为正向引物、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCT TTACTTTTTTCCAC-3′为反向引物进行三十二个循环的PCR基因扩增反应获得蝎毒素基因；用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-蝎毒素基因，通过共转染在昆虫细胞内与家蚕杆状病毒BmNPV DNA同源重组产生重组病毒；家蚕体内表达和重组蝎毒素纯化。本发明用家蚕幼虫表达的重组蝎毒素蛋白大部分留在家蚕脂肪体内，利用亲和层析从脂肪体中纯化蝎毒素，重组蝎毒素具有明显的生物学毒性，适合于生物制药产业化水平的要求，在未来的医学和临床治疗领域具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种以家蚕作为宿主生产重组蝎毒素蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以蝎cDNA为模板、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCTATGGATGGATATATAAG-3′为正向引物、以含有BglII酶切位点的5′-ACGTAGATCTTTACTTTTTTCCAC-3′为反向引物进行三十二个循环的PCR基因扩增反应获得蝎毒素基因，所述PCR基因扩增反应的第一个循环是在94℃模板变性50秒；第二个至第三十一个循环是先在55℃退火30秒，后在70℃延伸30秒；第三十二个循环是在70℃延伸7分钟；对PCR基因扩增反应获得的蝎毒素基因进行纯化，并将该蝎毒素基因克隆入3.9kb载体pCR2.1得到pCR2.1-蝎毒素，在核苷酸测序仪上测序确认pCR2.1-蝎毒素基因顺序的正确性；(2)用限制性内切酶BglII消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后将蝎毒素基因片段克隆入杆状病毒转移载体pAcGP67b获得重组体pAcGP67b-蝎毒素基因；通过共转染在家蚕培养细胞内与家蚕杆状病毒BmNPV DNA同源重组产生重组病毒，所述共转染的方法为：先将1μg pAcGP67b-蝎毒素基因DNA和15μgBmNPV DNA混合，接着加入14μl脂质体lipofectin，后又加入灭菌蒸馏水至终体积40μl，最后将该混合液在室温培育15分钟后共转染对数生长期的Sf21培养细胞；将上述通过共转染产生的重组病毒先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基于27℃培养5天后，收集培养基上清液作为病毒原液以用来筛选所述重组病毒；重组病毒通过3轮空斑筛选，最终获得高浓度纯化的重组BmNPV-蝎毒素病毒溶液，该BmNPV-蝎毒素病毒溶液的浓度为108pfu/ml；(3)先将5龄家蚕幼虫浸在冰水浴中进行麻醉，然后采用皮下注射的方法将浓度为106pfu/ml的重组BmNPV-蝎毒素病毒悬浮液注射入家蚕幼虫进行感染表达，每条家蚕注射20μl；注射1小时后对家蚕幼虫喂桑，并在23-25℃下饲养；在感染后72-96小时内收集家蚕幼虫，解剖感染后家蚕的脂肪体，并用该脂肪体作为纯化重组蝎毒素的起始材料；将所述脂肪体匀浆后溶解在预冷的pH为7.6的20mM Tris-HCl缓冲液中，经高速离心后将上清液直接上Ni-NAT亲和层析柱而使重组蝎毒素蛋白结合到层析柱上；然后用pH为7.6的20mMTris-HCl缓冲液洗脱去掉杂蛋白，最后用250mM咪唑缓冲液一步洗脱出结合的重组蝎毒素蛋白。