[发明专利]基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂

摘要

通过结合组织工程与化学技术，制备新型高效生物催化剂的新方法。该法选用微生物为种子细胞扩大培养后接种于支架材料上再经组织培养，制成细胞-支架三维空间复合体结构的组织工程细胞片，其细胞载量达80％以上，且支架中仍有足够通道供底物或产物进出；此片经聚乙烯醇/海藻酸钠包衣、在氯化钙溶液中成型、冻融成凝胶包衣片；包衣层中的海藻酸钙胶在磷酸盐中部分溶解形成微通道利于小分子传递；然后透性化处理提高凝胶包衣片中细胞胞内酶活性。从而构建细胞载量高、催化效力强、扩散限制小、机械强度好的透性化组织工程细胞凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂，并以此替代传统固定化细胞用于生物催化制备手性醇等重要手性药物与医药化工中间体。

主权项

基于组织工程方法构建新型高效生物催化剂，其主要步骤为：a)三维多孔支架的制备用适当溶剂将组织工程支架材料和适量致孔剂微晶(水溶性无机盐)制成均匀的混合物，加入到多孔培养板中，风干成胶后，用去离子水浸出微晶制成直径5～10mm、厚度3～6mm的三维多孔支架。b)细胞接种于三维多孔支架培养先将上述支架浸泡于一定浓度培养基或麦芽汁中并过夜。将种子细胞经扩大培养后按一定量接种到支架上，置于1～50℃水浴摇床轻微振荡1～200分钟后，将其移入多孔培养板中，再置于培养箱中在4℃～40℃培养1～10天，制得组织工程细胞片。c)对组织工程细胞片进行凝胶包衣取一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠加热至完全溶解，制成PVA和海藻酸钠的混合液。冷至室温。将制得的混合液滴于多孔板中的组织工程细胞片表面，放入包衣机中冷风吹5～120分钟至表面胶化；翻转组织工程细胞片后，再在其表面再滴上上述混合液，放入包衣机中开冷风吹5～120分钟至表面胶化。将凝胶包衣片从多孔板中取出，放入一定浓度CaCl2溶液中搅拌3～180分钟。洗净表面的CaCl2。反复冻融，增加包衣层机械强度。制得组织工程细胞凝胶包衣片。d)凝胶包衣层脱钙致孔把组织工程细胞凝胶包衣片放在一定浓度磷酸盐或柠檬酸或EDTA溶液中振荡一定时间，使凝胶层中的海藻酸钙溶解形成微孔通道，便于物质传输。e)透性化将上述形成微孔通道后的组织工程细胞凝胶包衣片，放在十六烷基三甲基溴化铵溶液(CTAB)或甲苯或乙醇混合溶剂中，在4～40℃处理2～120分钟，使细胞透性化，增加凝胶包衣片中细胞的酶活性。制得透性化组织工程细胞凝胶包衣片这种新型高效生物催化剂。液体环境：所述PVA水溶液在0.01％～15％(W/V)；所述海藻酸钠浓度在0.01％～6％(W/V)；所述CaCl2溶液浓度在0.1％～20％(W/V)；所述的磷酸盐或柠檬酸或EDTA浓度为0.01～1mol/L；透性化处理所用CTAB或甲苯或乙醇混合溶剂溶液为0.01％到8％；透性化时间为1～60分钟。