[发明专利]一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法

摘要

本发明提供的一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，其一取宰杀半小时内的卵巢，置入温度30-40℃，含青霉素和链霉素的生理盐水中，3小时内清洗3-4次，捡出卵母细胞；用25-30μmol/L的亮甲酚蓝，置于35-39℃水浴中染色85-92分钟，细胞质呈蓝色，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴放入55-78μl/滴的体外成熟培养液中，在5％CO2、95％的条件下培养；其二将体外成熟25-28小时的卵母细胞脱去卵丘细胞；体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的入50-70μl的受精液滴内；解冻精液，移入受精液，离心4-5分钟弃去上清液，将沉淀的精子，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，孵育；将受精12-18小时的卵取出，按上步方法处理移入四孔培养板内培养即可。其三所用试剂吸卵液、亮甲酚蓝成熟液、染色液SOF、受精液、培养液、羊血清的必备。

主权项

一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法，其特征在于：分为亮甲酚蓝染色筛选及培养的步骤；其一，摘取宰杀后半小时内的绵羊卵巢，置入温度30-40℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用其清洗3-4次，在显微镜下捡出卵母细胞；添加浓度为25-30μMol/L的亮甲酚蓝，置于35-39℃水浴中染色85-92分钟，待细胞质呈蓝色时，用体外成熟液洗涤3-4遍，按25-30枚/滴，放入前2小时平衡好的体积为55-78μl/滴的体外成熟培养液中，放入CO2箱，在5％CO2、95％的空气条件下培养；其二，将体外成熟25-28小时的卵母细胞取出，用0.1％的透明质酸酶处理30-60s，经吹吸，脱去部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4遍，按25-30枚/滴的密度加入前2小时平衡好的50-70μl的受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2小时平衡好的装有受精液的试管，放入CO2箱，上游20-25分钟，取上清，以1500转/分钟的转速离心4-5分钟弃去上清液；将剩余的精子沉淀，按2-4×106个/ml的密度加入受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；其三，将受精12-18小时的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4遍，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔的四孔培养板内培养，即完成体外受精筛选及培养。