[发明专利]一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法

摘要

本发明公开了一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。它包括一个以荧光定量PCR技术为基础的四重PCR反应体系，包含针对4种人乳头瘤病毒(HPV)基因型的正、反向引物和AllGlo荧光探针，在适合的PCR条件下可在一个反应管中同时检测最多包括HPV-6、-11、-16、-18的DNA载量，包括特异性引物及荧光探针的设计、标准分子的构建、标准曲线制备及临床标本检测。本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型HPV感染，实现了单管PCR同时分型检测四型HPV，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，对尖锐湿疣及常见型HPV致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少HPV感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。

主权项

一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)引物设计：在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-11、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；(2)荧光探针设计：根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；(3)标准分子的构建：根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；(4)四重荧光PCR反应液组成：使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2×qPCR Mix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；(5)四重荧光PCR反应的优化和建立：通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；(6)标准曲线制备：使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；(7)临床标本检测：用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。