[发明专利]一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法无效
| 申请号： | 200910162805.5 | 申请日： | 2009-08-07 |
| 公开（公告）号： | CN101659974A | 公开（公告）日： | 2010-03-03 |
| 发明（设计）人： | 辛文;耿亮;张琛;李爱玲 | 申请（专利权）人： | 北京全式金生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12P19/34 | 分类号： | C12P19/34 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 100101北京市朝*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I(DNATopoisomerase I)连接DNA片段的方法。本发明在引物设计中引入牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的识别序列，DNA片段扩增后，利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的酶切和/或连接功能连接DNA片段。并用于TA、UA、平端克隆及定向克隆载体构建，将该方法应用于试剂盒中，将大大方便使用者，为实现基因克隆、表达、蛋白功能等研究提供良好的技术平台。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 利用 牛痘 病毒 dna 拓扑 异构酶 连接 片段 方法 | ||
【主权项】：
1、一种利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I连接DNA片段的方法，其特征在于：通过引物设计，利用牛痘病毒DNA拓扑异构酶I的酶切和连接作用实现DNA片段的连接，其步骤包括：(1)设计引物：对至少两个待连接的DNA片段分别设计引物，每条待连接片段设计正向引物和反向引物，相邻连接处对应的前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5’到3’端依次包含接头DNA序列、牛痘病毒DNA拓扑异构酶I识别位点的互补DNA序列以及与相应模板配对的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接头序列反向互补配对，不同连接处的互补接头序列不同；(2)片段扩增分别以相应待连接DNA片段为模板，以各自的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；(3)片段连接将待连接片段混合，加入牛痘病毒DNA拓扑异构酶I，37℃15min，得到重组DNA片段。
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