[发明专利]一种P型ATP酶基因突变的检测方法

摘要

本发明涉及一种P型ATP酶基因突变的检测方法，属于分子生物学技术领域。所述的P型ATP酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组DNA，基因分型和结果分析。本发明的优点是：简单易行、可重复性高。

主权项

一种P型ATP酶基因突变的检测方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1.采集被测者口腔粘膜样本：用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔粘膜上皮细胞样本的基因组DNA，抽提时间为2-3小时，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；步骤3.基因分型：将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，2个反应孔分别检测ATP7B基因8号以及12号外显子突变情况，采用PCR技术进行扩增、凝胶电泳技术检测纯度、测序技术对这些位点确定基因型：步骤3-1，反应体系配置：在每一个反应孔中加入PCR标准反应体系，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，其中，PCR试剂5ul，正向引物和反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl，去离子水11.2ul；ATP7B基因第8外显子正向和反向引物如下：正向引物：ctcttggtcatccattcctg反向引物：catggtgttcagaggaagtgagATP7B基因第12外显子正向和反向引物如下：正向引物：actggtggaagaggctcaga反向引物：cctgcagaaggagagtgactg步骤3-2，PCR反应条件：将反应孔在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后降温至4℃；步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步：a.1％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bpDNA标记物6ul；c.步骤3-2的PCR产物4ul加入电泳缓冲液1ul；d.电泳电压：120v；e.电泳时间：20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；步骤3-4，纯化：在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系总体积为7ul，由去离子水ddH2O 3.825ul、PCR产物纯化试剂SAP 0.05ul、PCR产物纯化试剂EXON10.125ul、步骤3-3的PCR产物3ul；终浓度：PCR产物纯化试剂0.2U SAP 7ul，PCR产物纯化试剂2.5U EXON1/7ul；反应条件为：37℃、60min；80℃、15min；所得产物4℃恒温保存；步骤3-5，将纯化后的每一个反应孔进行测序，引物浓度为1uM，ABI 3730测序仪；步骤3-5-1，从4℃冰箱中取出步骤3-4的PCR纯化产物、测序试剂BigDye、四种dNTP、1uM测序引物，8号以及12号外显子测序引物分别为：ctcttggtcatccattcctg；actggtggaagaggctcaga；步骤3-5-2，记录日期、所作反应的PCR纯化产物名、所用引物、反应体系、测序试剂用量、PCR反应条件；步骤3-5-3，取一块反应板，标上模板名、测序引物名、日期；步骤3-5-4，每个样本需做两个PCR反应，用一个反应孔；步骤3-5-5，在每一个反应孔中加入反应体系，反应体系为0.5ul的BigDye、1.4ul的dNTP、2ul的测序引物、3ul的PCR纯化产物、0.1ul的去离子水ddH2O；体系分装好后，上离心机，达900转/分即停；步骤3-5-6，将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为预热96℃，10秒；再进行25个循环的96℃、10秒；50℃、5秒；60℃、4分钟；60℃、4分钟后降温至4℃恒温保存；步骤3-5-7，扩增结束后，在每孔加入1ul 125mM乙二胺四乙酸EDTA；步骤3-5-8，再在每孔加入无水乙醇15ul于室温进行沉淀，不得超过24小时；步骤3-5-9，将96孔板放入冰冻离心机，3650转/分，4℃离心30分钟；步骤3-5-10，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，再在每孔加30ul 70％乙醇，3650转/分，4℃离心15分钟，倒去上清液，将96孔板离心，达800转即停，将残余乙醇风干，室温放置20分钟；步骤3-5-11，每孔加入8ul重量比为15∶1的95％甲酰胺与ddH2O混合物；步骤3-5-12，在ABI 3730测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果：第8以及第12外显子都2类结果，即正常结果和突变结果；步骤4，结果分析：(1).未检出突变：您的检测结果中未发现ATP7B基因第8以及第12号外显子上存在突变；(2).检出突变：您的检测结果中发现ATP7B基因第8或第12号外显子上存在突变。