[发明专利]一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法

摘要

本发明提供了一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组DNA，基因分型和结果分析。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明2个位点的基因分型采用TaqMan-MGB技术进行分型。经实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。

主权项

一种细胞周期调节相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：步骤1.检测的样品类型与采样方法：用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法：采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；步骤3，荧光定量PCR反应：将每一个被测者样本分别放入2个反应孔，同时检测2个位点，即细胞周期素rs9344和丝氨酸/苏氨酸激酶15s2273535，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10μl，即2μl浓度为20ng/μl的DNA模板、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物、0.225μl浓度为20μM的反向引物、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针，其中，2个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光A型探针以及带FAM荧光G型探针如下：细胞周期素SEQ ID NO1：Rs9344：带VIC荧光A型探针：ACCCaGTAAGTGA带FAM荧光G型探针：ACCCgGTAAGTGA正向引物：TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC反向引物：TTGGCACCAGCCTCGGCATT丝氨酸/苏氨酸激酶15 SEQ ID NO2：Rs2273535：带VIC荧光A型探针：AAaTTGCTGAGT带FAM荧光T型探针：AAtTTGCTGAGT正向引物：AGAATTTGAAGGACACAAGA反向引物：TGCCAGAAAGTTTATTTTCT将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热：50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到细胞周期素rs9344、丝氨酸/苏氨酸激酶15s2273535两张图；步骤4：SNP基因型分析：将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的2个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、细胞周期素rs9344在检测结果图中，坐标轴左下区域黑点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(2)、丝氨酸/苏氨酸激酶15rs2273535在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。