[发明专利]基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法

摘要

一种基于猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus CSFV)NS3建立的间接ELISA方法，通过基因克隆表达技术，获取猪瘟病毒重组蛋白NS3。以重组蛋白NS3为包被抗原建立起间接ELISA方法，包括抗原重组蛋白NS3的制备、间接ELISA建立、判定标准的建立及临床血清学检测的应用。可用于猪群中CSFV NS3特异性抗体检测，以此判断猪群中CSFV NS3抗体水平、猪群中CSFV自然感染的情况，以及为CSFV E2基因工程标记疫苗提供鉴别ELISA检测方法。目前该方法是国际上首次利用CSFV NS3建立检测猪群中CSFV抗体的ELISA，其敏感性和特异性明显高于基于Ems建立的ELISA。

主权项

一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，其特征在于：该方法根据间接ELISA的原理建立，包括如下步骤：(1)、包被抗原的制备：根据GenBank中猪瘟病毒全基因序列(登录号：AF351433)，设计两条引物，上游引物fP：5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP：5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′；通过PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒cDNA中扩增到长度为2049bp NS3基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达载体pETNS3；将重组原核表达载体pETNS3转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞，经1mM IPTG诱导高效表达了重组蛋白NS3，该蛋白主要以包含体形式表达，部分为可溶性表达，采用Ni+亲和层析方法纯化得到重组蛋白NS3；(2)、以纯化后的猪瘟病毒重组蛋白NS3做包被抗原建立间接ELISA：①包被：用pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板，检测孔NS3蛋白包被量为200ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST洗涤2遍；②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，300μl/孔，37℃条件下封闭2h后甩干，用PBST洗涤3次；③血清作用条件：血清样品稀释液为PBST稀释5％脱脂奶粉，添加5％大肠杆菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀释为2μl/孔；37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；④酶标兔抗猪抗体作用条件：酶标兔抗猪抗体用PBST做104倍稀释后，100μl/孔，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；⑤底物显色：TMB底物100μl/孔，37℃条件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，终止反应；⑥读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；(3)、结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明试验成立，样品临界S/P值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P＜0.3判定为阴性。