[发明专利]嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列的方法

摘要

一种嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列：通过设计嵌套式特异性引物来扩增桔小实蝇rDNA特定的ITS片段，使用扩增桔小实蝇rDNA特定的ITS片段达到准确、快速鉴定果实中桔小实蝇卵，并通过序列对比确定其与近缘种的区分。该方法结果可靠，可快速检测出水果中桔小实蝇卵的存在，并经序列分析确定样品的种属进化关系。

主权项

一种嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列方法：(1)试验材料与方法：(1.1)供试样品和虫源将柑橘削去直径3-4厘米，厚度2毫米的外皮，放入培养箱，取经实验室饲养至成虫的桔小实蝇雌、雄各一只放入培养箱中，待雌虫产卵，取柑橘提取总的基因组DNA；(1.2)基因组DNA提取--CTAB法将柑橘削去外皮部分切割出长和宽为0.5厘米、厚0.2厘米的方块，用于基因组DNA提取；DNA的提取和质量检测方法参照分子克隆手册；DNA样品放于-20℃冰箱保存；具体如下：植物材料液氮冷冻一每个eppendorf管约0.05g--磨棒捣碎(快速)，然后加入500ul 2％CTAB，混匀，65℃保温30min以上，中间注意摇动，加入氯仿∶异戊醇——24∶1500ul震荡混匀，12000rpm，10min离心，取上清，加等体积的异丙醇，-20℃放置30min以上；再次10000rpm，5min离心，弃上清，用70％乙醇洗一次，10000rpm，5min离心，弃上清，彻底晾干，加30ul TE溶解基因组DNA；(1.3)引物设计引物设计参照NCBI上公开的桔小实蝇rDNA基因序列，第一轮PCR引物，正向引物PF-1：5’TGACCTAAGACATGCGCAGCTT 3’；反向引物PR-1：5’GGGACTTAAGGTCTAGGTCACA 3’；第一轮PCR产物DNA序列：tgacct aagacatgcg cagcttgcaa atgtttgggtttaaaattac aatttattga aagatgtgtt ggaattttat tttaaaaatt tgttataaatattattatta ttattctttc aataaattaa aaactcttga ctttgaatca aaaaacacaaaaaattttta ctctaagcgg tggatcactc ggctcatgca tcgatgaaga acgcagcaaactgtgcgtca tcgtgtgaac tgcaggacac atgaacatcg acattttgaa cgcatattgcggtccatgct gttatgtact ttaattaatt ttaaagtgct gcttggacta catatggttgagggttgtaa gactatggct aaattagttg cttattcttt tagttaatta aaagaatttaagcatatggt atattattgg attgtatttt ccaatccata atattaatag cataaaaagaaatatataca atatattctt gaatacctca tatttgaacg aaattttata ataaatgagaatcttagtat tcccaaaata aaaaaaaaat ttcaatatta tttaaaatat atttaaataaatacattacg aggacagtct agcataaaat atattcatat tgtgacctag accttaagtccc第二轮PCR引物，正向引物PF-2：5’tctaagcggtggatcact 3’；反向引物PR-2：5’tgctagactgtcctcgta 3’；引物合成由上海英骏生物技术有限公司合成；第二轮PCR产物DNA序列：tctaagcgg  tggatcactc ggctcatgca tcgatgaaga acgcagcaaactgtgcgtca tcgtgtgaac tgcaggacac atgaacatcg acattttgaa cgcatattgcggtccatgct gttatgtact ttaattaatt ttaaagtgct gcttggacta catatggttgagggttgtaa gactatggct aaattagttg cttattcttt tagttaatta aaagaatttaagcatatggt atattattgg attgtatttt ccaatccata atattaatag cataaaaagaaatatataca atatattctt gaatacctca tatttgaacg aaattttata ataaatgagaatcttagtat tcccaaaata aaaaaaaaat ttcaatatta tttaaaatat atttaaataaatacattacg aggacagtct agca(1.4)PCR反应体系及反应条件的优化PCR反应的扩增体积为20μL，包含1×PCR缓冲液，2mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTP，正反向引物各0.2μmol/L，1U Taq酶(Takara)，模板DNA 20～40ng；PCR扩增通用条件为94℃预变性2min，共运行30个循环；每一循环包括：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后一次循环后72℃延伸5min；样品在Biosystem Gene Amp PCR System 9700仪器上进行目的片段扩增；PCR产物在1％琼脂凝胶上电泳检测扩增效果；(1.5)PCR产物纯化回收PCR产物用QIAquick PCR Purification德国，QIAGEN试剂盒纯化PCR产物；(1.6)序列测定PCR产物经纯化以后，送样直接测序；(1.7)DNA序列数据处理与对比用DNAstar软件编辑获得的DNA测序的序列文件，在NCBI上进行BLAST，对比相近种并进行分析；(2)结果与分析：(2.1)样品基因组DNA提取将不同产卵时期的柑橘样品切割成长和宽0.5厘米、厚度0.2厘米方块，本试验中所用柑橘试验材料，肉眼无法分辨出是否带有实蝇卵，需要在体视显微镜下计卵数，按卵数将样品分成3个等级，S1：1-10个卵/块，S2：10-100个卵/块，S3：100-500个卵/块；分别将样品加入液氮研磨，提取基因组DNA；将待测样品分级，目的是探测PCR技术在鉴定含不同量桔小实蝇卵的柑橘果实的效率；供试样品基因组DNA提取是按照传统植物材料基因组DNA提取方法进行，提取的DNA样品OD值测定只是对柑橘果实组织基因组DNA含量及质量的测定，对实蝇卵基因组DNA含量及所占比例无法估计；(2.2)PCR引物设计在NCBI上搜索到桔小实蝇的18S rRNA基因片段，登录号为AF276516，是一个未完全的rDNA基因的部分片段，大小为1522bp，依据该序列，设计了两套PCR引物，第一轮PCR引物扩增目的片段大小为637bp，其中正向引物位于rDNA间隔区ITS-1内，该区是一个多变区，可用以区分形态学方法难以鉴别的近缘种的关系；反向引物位于rDNA间隔区ITS-2内，同样该区也是一个变异较大的区，可用于鉴定近缘关系；第二轮PCR引物扩增目的条带大小为432bp，该片段被包含在第一轮PCR片段中；其正向引物位于5.8S rRNA基因内部，这是一个非常保守的区域，可用来鉴别不同的物种；PCR引物在rDNA中的位置；第二轮PCR反向引物位于rDNA间隔区ITS-2内。