[发明专利]一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法

摘要

一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法采用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列：通过设计嵌套式特异性引物来扩增桔小实蝇rDNA特定的ITS片段，达到准确、快速鉴定果实中桔小实蝇卵，并通过序列对比确定其与近缘种的区分。该方法结果可靠，可快速检测出水果中桔小实蝇卵的存在，并经序列分析确定样品的种属进化关系。

主权项

一种快速检测水果中桔小实蝇卵的分子诊断方法：使用的PCR方法用于快速鉴定果实中桔小实蝇卵，即利用嵌套式PCR扩增桔小实蝇rDNA中ITS间断序列进行快速鉴定果实中桔小实蝇卵：(1)PCR检测样品中桔小实蝇卵首先用通用的PCR程序去扩增三个样品中目的片段，既PCR扩增条件为94℃预变性2min，共运行30个循环；每一循环包括：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后一次循环后72℃延伸5min；PCR产物点入1％琼脂糖凝胶，电泳检测结果；第一轮PCR产物大小为637bp，从该PCR反应液中取出2微升稀释100倍，再从稀释样品中取1微升作为下一轮PCR的模板，第二轮PCR产物大小为432bp；普通的PCR程序能够检测出柑橘果实中桔小实蝇的rDNA基因片段，本试验设计的嵌套式PCR引物均正常工作；含不同数量桔小实蝇卵的柑橘果实样品，通过PCR扩增实蝇rDNA片段，都得到很强的目的条带；(2)PCR程序优化鉴于通用PCR程序对3组果实样品中的桔小实蝇卵都扩增出很强的条带，我们把PCR程序进一步优化，以达到缩短PCR运行时间，快速鉴定目的条带；PCR循环数设定为5(C1)、15(C2)、25(C3)，对桔小实蝇卵含量最少的样品S1进行PCR鉴定；PCR产物电泳结果，循环数降低对PCR产物量影响很大，基于有利于鉴定，我们选取循环数15(C2)为可识别的标准值；(3)PCR片段序列对比从电泳后的琼脂糖凝胶中分别回收两轮PCR产物，纯化后直接送样测序；序列对比分析发现，本试验中第二轮PCR产物GS-F，片段大小为432bp，其全序列与第一轮PCR产物GB-F，片段大小为637bp的部分序列完全相同，且被包含于其中；证明第二轮PCR产物是第一轮PCR产物的特异扩增片段；二者DNA序列对比，可以确定，第二轮PCR产物GS-F是第一轮PCR产物GB-F的一部分；将PCR产物GB-F的DNA序列进行生物信息分析，PCR产物GB-F片段序列跨越桔小实蝇rDNA间隔区ITS-1与ITS-2；通过将GB-F的DNA序列在NCBI上进行BLAST，所检测的实蝇卵与桔小实蝇亲缘关系最近，序列对比二者间同源性百分之百，因此可确定本试验所用虫源是桔小实蝇；生物信息分析结果进一步确证了本试验中设计的嵌套式PCR引物能够精确、快速鉴定出果实样品中的桔小实蝇卵。