[发明专利]利用特异性引物对大菱鲆FF0922微卫星标记的检测方法

摘要

一种利用特异性引物对大菱鲆FF0922微卫星标记的检测方法，首先提取大菱鲆基因组DNA；再利用大菱鲆微卫星富集文库中的含有微卫星序列，在其序列两端设计的特异性引物为正链5’TGTGAGAAAACAGGCAATC-3’，负链5’-CAGTTTCTGTGATTTGGTGAT-3’；并对大菱鲆基因组DNA进行PCR扩增，将获得的PCR产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；对产物出现的条带进行分析，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明适用于大菱鲆群体遗传标记、系谱认证、遗传连锁图谱构建等检测技术；PCR扩增产物在大菱鲆群体检测中呈现较好多态性；本发明可快捷的获得大菱鲆的FF0922微卫星标记的遗传变异图谱，方便、快捷、准确，可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。

主权项

一种利用特异性引物对大菱鲆FF0922微卫星标记的检测方法，其特征在于它的技术操作程序是：首先提取大菱鲆DNA；再利用大菱鲆基因组文库中FF0922克隆的微卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对大菱鲆不同地理群体或群体内不同个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得大菱鲆FF0922核心序列区的遗传多样性变异图谱；所述的提取的大菱鲆基因组DNA，稀释为50ng/ul，在其每个PCR反应中加入2ul反应总体积为25ul；所述的PCR扩增：其加样参数为：每个PCR反应总体积为25ul，包括100ng大菱鲆基因组DNA；10×PCR buffer，2.5ul；Mg2+，2mmol/L；Taq酶1U；dNTP各0.2mmol/L；FF0922微卫星核心序列两端设计的引物各0.2umol/L；加ddH2O至25ul；使用该引物时设置PCR仪的程序为94℃变性4min；94℃30sec，60℃50sec，72℃50sec，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存；所述的PCR产物进行检测：将PCR产物在浓度为8％变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离；将带有PAGE胶的板放入浓度为10％冰醋酸溶液中摇动至胶全部脱色；用超纯水漂冼胶板2次；加入显色液轻轻摇动；用超纯水快速冲洗胶板两面以除去凝胶表面的染色液；将胶板快速转移到冷却的显色液中直至带纹出现；将胶板快速移动到10％冰醋酸溶液中轻摇3-5min；用超纯水清洗玻璃板；将胶板置于室温下自然干燥；可得到大菱鲆FF0922基因座位的遗传多态性图谱；其特征在于所述的：FF0922微卫星核心序列及其两端保守序列为： 1ATGTGCTGTG TCAGACTGTT TATCTGTGAG AAAACAGGCA ATCAGAGAGG 51GCGCTCACAT ATTATTGAAA TGACATGAAA TCCATGTTAC TCCACACTCA101AGTCGTATAT GCAAGCTAGA ATGGTGAATC TCTTCTTGTC TCCTACAGAC151AGACAAACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACAAACACAT201ACACAAAACA AGACCAACAG TGACATGATA TAACATGATC ACCAAATCAC251AGAAACTGTA GGGGAGAAGG GGAAAAAAAG CTAATAAAGC TATAGCAAAA301TTAGAACTGT GCTGTAGGCA GATCCAGTGT CTCCAGTAAT CTACATAAGC351AGCAGTTGTC GT；其核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-TGTGAGAAAACAGGCAATC-3’，负链5’-CAGTTTCTGTGATTTGGTGAT-3’；该引物的退火温度为60℃。