[发明专利]一种大规模筛查扇贝SNP的方法

摘要

本发明属于扇贝DNA分子遗传标记技术领域的一种大规模筛查扇贝SNP标记的方法，先用溶液D和酚氯仿提取多个栉孔扇贝RNA，按比例混匀后紫外分光光度计测定其浓度备用；再构建扇贝全长cDNA样品，包括cDNA第一链合成和cDNA第二链的合成与扩增；然后进行全长cDNA均一化，再进行超声波打断；然后连接测序接头，包括末端修复、接头连接和样品扩增；最后用生物学软件分析数据得到SNP标记；再选取筛查的SNP标记，设计引物；提取扇贝个体的DNA，等量混合作为模板，PCR扩增后进行常规克隆测序，将单碱基差异出现频率在10％及以上的位点定义为SNP标记；其原理安全可靠，工艺步骤简单易控，大规模筛选运行可靠，效果优良，应用性强。

主权项

一种大规模筛查扇贝SNP的方法，其特征在于：(1)、用溶液D和酚氯仿提取多个栉孔扇贝RNA，按比例混匀后紫外分光光度计测定其浓度备用；(2)、构建扇贝全长cDNA样品：参照SMARTTM cDNA Library Construction Kit，将cDNA合成引物的序列替换为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTTV-3’；①、cDNA第一链合成：反转录反应以1ug RNA为模板，补RNase-Free水至4ul，加入1ul 10uM cDNA合成引物、1ul 10uM SMART IVTM Oligonucleotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’)，70C温育3min，立即置冰上冷却1min；再加入1×First-Strand Buffer、1mM dNTP、0.01M DTT、1U SuperscriptII，混匀后42℃温育1h，65℃温育3min终止第一链的反应；②、cDNA第二链的合成与扩增：PCR反应总体积为30ul，包含1ul稀释5倍的cDNA  第一链产物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)，1U Advantage 2Polymerase Mix，1×Advantage 2PCR buffer，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，进行15-19个循环，平行扩增16管，回收纯化扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测；(3)、全长cDNA均一化：具体步骤参照市售的TRIMMER-DIRECT cDNA均一化说明书进行，均一化后再次扩增，PCR反应总体积为30ul，包含1ul cDNA均一化产物，250uM dNTP，0.46uM NUP引物，1U Advantage 2Polymerase Mix，1×Advantage 2PCRbuffer；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸6min，进行15-19个循环，平行扩增16管，回收纯化扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测；(4)、超声波打断：取200ul浓度为50-100ng/ul的cDNA于冰浴的1.5ml离心管，将超声波破碎仪的锥形探头浸没液面以下，20W功率破碎20s，1％琼脂糖凝胶电泳检测片断大小，片段集中在100～800bp之间，经过打断的样品回收纯化后电泳和紫外分光光度计检测；(5)、连接测序接头：①、末端修复：体系为12.5ul，包含50ng打断纯化后cDNA，1X NEB2buffer，1X BSA，500uM dNTP，1.8U T4DNA polymerase，12U Klenow fragment of DNApolymerase I，混匀后，室温下放置90min，70℃温浴15min终止反应，室温下冷却；②、接头连接：连接体系为25ul，包含上步产物12.5ul，加入1X T4DNA ligasebuffer，2uM adaptor A，接头组成为5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGT-3’和5’-ACCTGCGCGG-3’，2uM adaptor B，接头组成为5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGCGGCCA-3’和5’-TGGCCGCTCGT-3’，2500U T4DNA ligase，12℃过夜，加入100ul无菌水稀释5倍后65℃温浴10min，冷却至室温，纯化回收连接产物，紫外分光光度计检测；③、样品扩增：PCR反应总体积为30ul，包含约40ug连接回收产物，250uMdNTP，2uM A引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAG-3’)，2uM B引物(5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3’)，0.005uM  A+halfswitch引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTACGTATCAACGCAGAGTACGCGG-3’)，0.005uM A+TrsaC引物(5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGCCGCGCAGGTCGCAGTCGGTACTTTTTTCTTTTTT-3’)，1×Advantage 2PCR buffer，1U Advantage 2Polymerase Mix，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸4min，进行15-19个循环，平行扩增16管，反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，产物应为100～1000bp的弥散带，切胶回收300-800bp的片段5ug；454FLX-titanium上机，完成测序；(6)、数据分析：用市售的生物学软件分析数据，得到SNP标记；(7)、SNP标记验证：选取100个筛查的SNP标记，设计引物；提取40个栉孔扇贝个体的DNA，等量混合作为模板，PCR扩增后进行常规克隆测序，每个位点扩增序列测20个克隆，将单碱基差异出现频率在10％及以上的位点定义为SNP标记。