[发明专利]一种利用胶体金相互聚集检测生物素标记的DNA的方法

摘要

一种基于不同修饰的胶体金聚集和银染信号扩增的DNA测定方法，属于分析生物化学技术领域。该发明主要内容是使两种修饰不同生物分子的胶体金发生结合，将DNA信号放大。首先将生物素标记的单链DNA通过共价交联固定到基片表面上，再加入链霉亲和素修饰的胶体金，使之结合到生物素标记的单链DNA上，然后加入生物素修饰的胶体金，使两种修饰不同生物分子的胶体金发生结合，重复这一过程，将DNA信号放大，最后，利用银染方法进一步放大信号。通过使用该方法，发现在一定的物质的量范围内，点样处生成的灰度值与物质的量的对数值具有较好的线性关系。该方法是一种灵敏度高，特异性好的可视化检测DNA的方法，在诸多领域有应用潜力。

主权项

一种基于不同生物分子修饰的胶体金相互聚集的检测生物素标记的DNA的方法，其特征是步骤为：(1)胶体金的制备；(2)DNA修饰的胶体金的制备；(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备；(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验；(5)扫描及数据分析。(1)胶体金的制备：利用Frens法制备13nm的胶体金；所用的玻璃仪器使用铬酸洗液浸泡后，双蒸水清洗，烘干备用；制备时向500mL烧杯中加入一定量的氯化金溶液，再加入超纯水至250mL，加热。将溶液加热至沸腾后，立即加入一定量的柠檬酸三钠溶液，继续加热，搅拌，沸腾15分钟后，停止加热。这一过程中可观察到溶液的颜色由黄色变为深紫色，进而变为透明的深红色。冷却至室温后，将胶体金用微孔滤膜进行过滤，4℃保存。(2)biotin标记的DNA修饰的胶体金的制备：利用巯基与胶体金的相互作用，将biotin标记的DNA修饰到胶体金表面；向1mL的AuNP中加入一定量的5’巯基修饰的ssDNA，避光摇一段时间，然后向溶液中加入微量的磷酸缓冲液和一定量的NaCl溶液使其Na+浓度递增，当Na+浓度升至0.1M，停止反应，再加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心。离心结束后，弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBST中。然后向溶液中加入一定量的5’biotin修饰的ssDNA，长时间避光摇后离心，弃上清，沉淀溶解于PBS中。(3)链霉亲和素修饰的胶体金的制备：利用蛋白质与胶体金的静电吸附作用将链霉亲和素修饰到胶体金表面；向1mL的AuNP中加入一定量的链霉亲和素(SA)，避光摇一段时间，向溶液中加入一定量的NaCl溶液使其Na+浓度递增，升至0.1M后，加入小牛血清白蛋白封闭，1h后离心。弃上清，将红色油状沉淀溶解于PBS缓冲液中。(4)不同生物分子修饰的胶体金相互聚集及银染实验：利用生物素与链霉亲和素的相互作用，使两种不同修饰的胶体金发生聚集，使信号放大，然后进行银染进一步增强信号；将5’biotin修饰的ssDNA稀释成不同浓度，分别取1μL点于醛基基片上，对照组使用无修饰的ssDNA。将基片置于恒温恒湿环境中反应一段时间。然后将基片置于鲑精DNA封闭液中封闭。封闭结束后用PBST洗三次。向反应池中加入一定量的链霉亲和素修饰的胶体金(SA-AuNP)，孵育一段时间。之后用PBST洗三次。再向反应池中加入一定量的biotin标记的DNA修饰的胶体金(DNA-AuNP)，孵育一段时间。之后用PBST洗三次。重复上述孵育过程，孵育结束后对基片进行银染。对照组分别仅使用AuNP，DNA-AuNP和SA-AuNP孵育。(5)扫描及数据分析；将银染后的基片进行扫描，使用ImageJ软件分析其灰度值，使用oringe6.0软件分析其线性相关系数及相对标准偏差。